?HEK293 細胞及其種類
人胚胎腎細胞系(Human Embryonic Kidney, HEK293)的起源可追溯至1973年，因轉染了人5型腺病毒(Ad5)DNA片段而成為了永生化細胞系，約4Kb的Ad5基因組(包含E1A和E1B基因)被整合進入HEK293的19號染色體上。隨后，科研人員在HEK293原代細胞系上又相繼衍生出多種不同的HEK293細胞系，用于不同方向的研究和應用。主要包括：HEK293、HEK293T、HEK293E、HEK293F、 HEK293S、HEK293SG、和HEK293H等(如圖1)【1】。
圖1 常見的不同商業(yè)化HEK293細胞系
?HEK293 細胞系的特點及應用
CHO細胞、BHK細胞、Sp2/0等哺乳動物細胞常被用于制備生物制藥。然而這些小鼠來源的細胞與HEK293細胞表達的重組蛋白相比，翻譯后的修飾存在差異。不同的修飾可能會直接影響蛋白的生物活性、半衰期、免疫原性等多種功能。HEK293細胞系除了具有人源的翻譯后修飾能力，還具有其他許多優(yōu)勢：
1.在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長的能力；
2.對多種轉染方式的兼容性；
3.快速分裂與表達等。
這些HEK293細胞系的優(yōu)異特性也一直吸引著科研人員不斷探索，如今HEK293及其衍生細胞系已經廣泛應用于科學研究和生物制藥行業(yè)中，HEK293對于病毒易感性也使得它成為生產流感病毒、慢病毒、重組腺病毒和重組腺相關病毒的載體。目前，已有多款基于HEK293細胞的產品獲批在歐洲和美國上市(如圖2)【2】。
圖2 基于HEK293細胞的上市產品示例
?HEK293 細胞的培養(yǎng)技術優(yōu)化
HEK293細胞培養(yǎng)中會涉及到原材料、設備和技術等多方面的影響。
1.原材料: 主要包括培養(yǎng)基、消化劑、微載體等。目前，各政府或全球相關組織的法規(guī)制度對產品的安全性要求越來越高，所以更多的生產商會選擇使用無動物源成分(ADCF)的培養(yǎng)基進行生產。
2.設備: 大規(guī)模培養(yǎng)細胞一般會需要用到WAVE反應器和生物反應器兩種，因此需要兩種反應器對于pH、溶氧(DO)、二氧化碳(CO2)、溫度、壓力、通氣氣泡大小、轉速等的控制和監(jiān)測要求比較高。百林科作為生物制藥工藝核心解決方案供應商，致力于為生物制藥企業(yè)提供更高效趁手的工具，從而助力藥物的發(fā)展和創(chuàng)新。由百林科自主研發(fā)生產的CytoLinX® WB 系列一次性波浪式生物反應器，采用先進的 PID 反饋控制技術和光纖電極光補償技術，可進一步助力生物制藥企業(yè)提高細胞培養(yǎng)工藝的穩(wěn)定性和可靠性：
CytoLinX® WB 系列一次性波浪式生物反應器
CytoLinX® WB具備以下優(yōu)勢
精準控制
通過精準的檢測及反饋調節(jié)功能，進行準確的溫度、轉速、PH、DO等參數(shù)控制，并且可以實現(xiàn)細胞培養(yǎng)過程的多方位監(jiān)控和數(shù)據采集，更適合HEK293細胞培養(yǎng)。
低剪切力
輕柔的波浪式搖擺，將對細胞的剪切力降低，減少對細胞造成的損傷。
托盤可切換
設備托盤可方便置換 10L，20L，50L培養(yǎng)袋，無需拆擰螺絲，簡單快速完成培養(yǎng)袋安裝操作。
灌流功能
支持灌流功能，泵流速具有自動校準功能，實現(xiàn)精準補料及收獲。
密閉系統(tǒng)
減少外源性污染的風險。
一次性無菌耗材
采用預先輻照滅菌的細胞培養(yǎng)袋，杜絕污染風險，有效避免反應器的清洗和驗證，縮短工藝開發(fā)和生產周期。
同時，百林科提供的CytoLinX® WB 系列一次性細胞培養(yǎng)袋專為生物制藥常見的細胞培養(yǎng)應用設計，可匹配百林科或者市場上其他主流供應商的波浪式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)使用。
工作體積：300 mL-25 L
3. 培養(yǎng)技術：培養(yǎng)技術的提升一般需要積累的經驗，細胞的培養(yǎng)、細胞的轉染和提升重組蛋白表達策略等幾個環(huán)節(jié)進行技術優(yōu)化的簡介。
a) 細胞的培養(yǎng)
傳代過程中首先要避免支原體及其他污染。培養(yǎng)基可根據不同細胞系和法規(guī)選擇不同 的類型。培養(yǎng)過程中根據DoE摸索細胞培養(yǎng)的最適溫度、轉速、pH、DO濃度、CO2濃度、氣泡大小、灌流參數(shù)等條件并建立SOP。
b) 細胞的轉染
生產中細胞轉染常用的轉染試劑為線性化聚乙烯亞胺(Polyethylenimine Linear, PEI)，濃度1mg/mL。一般推薦PEI:DNA的比例為1:1到3:1之間。
c) 提升重組蛋白表達量的策略
一般表達重組蛋白時，總會有一些重組蛋白的表達量很低，導致成本增加，純化困難。遇到這種情況，我們可以選擇優(yōu)化目的蛋白的密碼子；在目的基因ATG前面加入Kozak序列(GCCACC)促進mRNA轉錄；優(yōu)化信號肽和跨膜區(qū)(如果有的話)；DoE摸索表達時間和轉染劑量；細胞存在異質性，可通過篩選單克隆以篩選出高表達細胞株。
?HEK293 細胞培養(yǎng)案例分享
HEK293細胞培養(yǎng)工藝路線為：
搖瓶擴增→接種至WB反應器進行培養(yǎng)。
每日取樣檢測細胞活率和密度，根據細胞狀態(tài)補料。
結論
使用CytoLinX® WB 一次性波浪式生物反應器流加培養(yǎng)HEK293細胞，細胞培養(yǎng)生長趨勢與搖瓶對照組以及歷史批次趨勢基本一致，結果符合預期，成功從搖瓶培養(yǎng)放大到波浪式反應器培養(yǎng)。
參考文獻
1. Abaandou L, Quan D, Shiloach J. Affecting HEK293 Cell Growth and Production Performance by Modifying the Expression of Specific Genes. Cells. 2021 Jul 2;10(7):1667.
2. Pulix M, Lukashchuk V, Smith DC, Dickson AJ. Molecular characterization of HEK293 cells as emerging versatile cell factories. Curr Opin Biotechnol. 2021 Oct;71:18-24.
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