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測(cè)定意義：

THL（EC 3.2.1.28）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。海藻糖酶主要功能在于生物體分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供應(yīng)。

測(cè)定原理：

THL催化海藻糖產(chǎn)生葡萄糖，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生*；過(guò)氧化物酶催化*氧化4-氨基安林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在505 nm有特征吸收峰，以此反映THL活性。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體6mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體 10ml×1瓶，4℃保存；

試劑三：液體 10ml×1瓶，4℃保存；（若出現(xiàn)結(jié)冰現(xiàn)象，可37℃水浴溶解后使用）

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），冰浴中勻漿。8000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL提取液），冰浴中勻漿。8000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 調(diào)節(jié)水浴鍋至95度。

3. 工作液的配制：使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合，用多少配多少。

4、加樣表：

45℃水浴，準(zhǔn)確反應(yīng)15min，95℃水浴5分鐘終止反應(yīng)，得混合液(若出現(xiàn)沉淀可10000g

 4℃離心10min后取上清)。

混勻，置37℃（哺乳動(dòng)物）或25'C（其它物種）保溫15min后，于505nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

THL活力計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.4858x - 0.0042，R2 = 0.9999；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×1000

 =366× (ΔA+0.0042) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL活力(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=366×(ΔA+0.0042)÷W

4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL活力(nmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V反總÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=0.732×(ΔA+0.0042)

5、按血清（漿）體積計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL活力(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V反總÷(V液 ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=3660×(ΔA+0.0042)

V樣：加入樣本體積：0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.08mL；V液：加入血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，15min；

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.2429x - 0.0042，R2 = 0.9999；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×1000

 =732× (ΔA+0.0042) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL活力(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=732×(ΔA+0.0042)÷W

4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL活力(nmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V反總÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=1.464×(ΔA+0.0042)

5、按血清（漿）體積計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

THL活力(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V反總÷(V液 ×V樣÷V樣總) ÷T×1000

=7320×(ΔA+0.0042)

V樣：加入樣本體積：0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.08mL；V液：加入血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，15min；

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