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測(cè)定意義：

蔗糖酶（EC 3.2.1.26）是碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶之一，能夠水解蔗糖變成相應(yīng)的單糖而被機(jī)體吸收。

測(cè)定原理：

本試劑盒采用3.5－二硝基水楊酸法測(cè)定蔗糖酶催化產(chǎn)生的還原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。此法操作簡(jiǎn)便、迅速、雜質(zhì)干擾較小。

所需的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、沸水浴、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體2mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1支 ，4℃保存，用時(shí)加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存；

試劑三：液體3mL×1瓶，常溫保存；

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備： 

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至520nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 樣本測(cè)定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

置于25℃準(zhǔn)確水浴10min

混勻， 95℃水浴5min左右（蓋緊，防止水分散失），冷卻至室溫

混勻，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中測(cè)定各管520nm吸光值，ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照，每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

蔗糖酶活力計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.1296x -0.12；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化水解1μg蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(V1×Cpr)÷T=771×(ΔA +0.12)÷Cpr。

3、按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化水解1μg蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/g鮮重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=771×(ΔA +0.12) ÷W。

1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0648x -0.12；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化水解1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.0648×V1]÷(V1×Cpr)÷T=1542×(ΔA +0.12)÷Cpr。

3、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化水解1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/g鮮重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.0648×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=1543×(ΔA +0.12) ÷W。

1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

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