1．概要
這個(gè)軟骨藻酸（ASP）ELISA檢測(cè)方法可以很敏感的定量檢測(cè)軟骨藻酸的含量。軟骨藻酸是和健忘性貝類毒素相關(guān)的一類海藻產(chǎn)生的水溶性毒素。試劑盒用于定量或定性檢測(cè)檢測(cè)水樣和貝類樣品中軟骨藻酸的含量。貝類樣品需要進(jìn)行樣品前處理。如果需要可以用傳統(tǒng)的方法例如HPLC,GC/MS來(lái)證實(shí)。
2．安全說(shuō)明
試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)溶液里含有少量的軟骨藻酸。底物中包含有四甲基聯(lián)苯胺，終止液中含有稀硫酸。要避免
皮膚和粘膜與終止液接觸，如果不小心接觸了請(qǐng)馬上用水沖洗。
3．保存和穩(wěn)定性
試劑盒應(yīng)保存在2-8℃，不要冷凍。在使用之前要把試劑盒中的溶液回復(fù)到室溫（20-25℃）。有效期內(nèi)試劑盒中的試劑都可以使用。
4．原理
試劑盒的原理是直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，通過(guò)特異性抗體來(lái)識(shí)別軟骨藻酸。當(dāng)樣品中含有軟骨藻酸時(shí)，樣品中的軟骨藻酸與軟骨藻酸酶結(jié)合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合溶液中的軟骨藻酸抗體。軟骨藻酸抗體與包被在微孔板上的羊抗鼠二抗結(jié)合。經(jīng)過(guò)一步洗滌加入底物溶液，產(chǎn)生有色反應(yīng)。產(chǎn)生的綠色的顏色深度與樣品中軟骨藻酸的含量成反比。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定吸光度值。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣品中軟骨藻酸的含量。
A．試劑盒組成：
1、包被二抗的微孔板（羊抗鼠）
2、標(biāo)準(zhǔn)（5種）0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/ml
3、1瓶對(duì)照（1ml）濃度3.5 ng/ml
4、軟骨藻酸抗體溶液（鼠抗軟骨藻酸）6ml
5、軟骨藻酸酶標(biāo)記物6ml
6、樣品稀釋液（25ml）用于稀釋樣品
7、5x 濃縮洗液100ml
8、顯色液（底物）TMB,16ml
9、終止液12ml
C.操作步驟
1、在對(duì)應(yīng)的微孔中加入50μL的標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照和樣品（*做2-3個(gè)重復(fù)）
2、每個(gè)測(cè)試孔都加入50 μL軟骨藻酸酶標(biāo)記物溶液。
3、每個(gè)測(cè)試孔都加入50 μL軟骨藻酸抗體溶液，用封口膜把微孔板蓋上，輕輕的震蕩微孔板30秒使里面的液體混勻。不要使液體灑出。
4、在室溫下孵育60分鐘。
5、孵育完成后，把封口膜取掉，將微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1 X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL1 X的洗液。拍板，去掉殘留的洗液。
6、每個(gè)測(cè)試孔加入100μL的顯色液（底物）。室溫孵育30分鐘，此步驟避免太陽(yáng)光照射。
7、每個(gè)測(cè)試孔加入50μL終止液。
8、用酶標(biāo)儀在450nm 下讀取每個(gè)孔的吸光度值（OD）（在加入終止液15分鐘內(nèi)完成）
D 結(jié)果分析
結(jié)果分析可以利用商業(yè)ELISA分析軟件（4-parameters,Logit/Log）。手工計(jì)算可以先計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值的平均值，然后計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0（用其它標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值除以零標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值乘以*）。以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0做Y軸，以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的軟骨藻酸的濃度做X軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，把對(duì)照和樣品的%B/B0代入標(biāo)準(zhǔn)可以計(jì)算出樣品中軟骨藻酸的濃度軟骨藻酸的含量小于0.5 ppb認(rèn)為陰性。當(dāng)樣品中軟骨藻酸的含量大于10.0 ppb要稀釋后再測(cè)定。
1．概要
這個(gè)軟骨藻酸（ASP）ELISA檢測(cè)方法可以很敏感的定量檢測(cè)軟骨藻酸的含量。軟骨藻酸是和健忘性貝類毒素相關(guān)的一類海藻產(chǎn)生的水溶性毒素。試劑盒用于定量或定性檢測(cè)檢測(cè)水樣和貝類樣品中軟骨藻酸的含量。貝類樣品需要進(jìn)行樣品前處理。如果需要可以用傳統(tǒng)的方法例如HPLC,GC/MS來(lái)證實(shí)。
2．安全說(shuō)明
試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)溶液里含有少量的軟骨藻酸。底物中包含有四甲基聯(lián)苯胺，終止液中含有稀硫酸。要避免
皮膚和粘膜與終止液接觸，如果不小心接觸了請(qǐng)馬上用水沖洗。
3．保存和穩(wěn)定性
試劑盒應(yīng)保存在2-8℃，不要冷凍。在使用之前要把試劑盒中的溶液回復(fù)到室溫（20-25℃）。有效期內(nèi)試劑盒中的試劑都可以使用。
4．原理
試劑盒的原理是直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，通過(guò)特異性抗體來(lái)識(shí)別軟骨藻酸。當(dāng)樣品中含有軟骨藻酸時(shí)，樣品中的軟骨藻酸與軟骨藻酸酶結(jié)合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合溶液中的軟骨藻酸抗體。軟骨藻酸抗體與包被在微孔板上的羊抗鼠二抗結(jié)合。經(jīng)過(guò)一步洗滌加入底物溶液，產(chǎn)生有色反應(yīng)。產(chǎn)生的綠色的顏色深度與樣品中軟骨藻酸的含量成反比。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定吸光度值。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣品中軟骨藻酸的含量。
A．試劑盒組成：
1、包被二抗的微孔板（羊抗鼠）
2、標(biāo)準(zhǔn)（5種）0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/ml
3、1瓶對(duì)照（1ml）濃度3.5 ng/ml
4、軟骨藻酸抗體溶液（鼠抗軟骨藻酸）6ml
5、軟骨藻酸酶標(biāo)記物6ml
6、樣品稀釋液（25ml）用于稀釋樣品
7、5x 濃縮洗液100ml
8、顯色液（底物）TMB,16ml
9、終止液12ml
C.操作步驟
1、在對(duì)應(yīng)的微孔中加入50μL的標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照和樣品（*做2-3個(gè)重復(fù)）
2、每個(gè)測(cè)試孔都加入50 μL軟骨藻酸酶標(biāo)記物溶液。
3、每個(gè)測(cè)試孔都加入50 μL軟骨藻酸抗體溶液，用封口膜把微孔板蓋上，輕輕的震蕩微孔板30秒使里面的液體混勻。不要使液體灑出。
4、在室溫下孵育60分鐘。
5、孵育完成后，把封口膜取掉，將微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1 X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL1 X的洗液。拍板，去掉殘留的洗液。
6、每個(gè)測(cè)試孔加入100μL的顯色液（底物）。室溫孵育30分鐘，此步驟避免太陽(yáng)光照射。
7、每個(gè)測(cè)試孔加入50μL終止液。
8、用酶標(biāo)儀在450nm 下讀取每個(gè)孔的吸光度值（OD）（在加入終止液15分鐘內(nèi)完成）
D 結(jié)果分析
結(jié)果分析可以利用商業(yè)ELISA分析軟件（4-parameters,Logit/Log）。手工計(jì)算可以先計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值的平均值，然后計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0（用其它標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值除以零標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值乘以*）。以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0做Y軸，以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的軟骨藻酸的濃度做X軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，把對(duì)照和樣品的%B/B0代入標(biāo)準(zhǔn)可以計(jì)算出樣品中軟骨藻酸的濃度。樣品中軟骨藻酸的含量小于0.5 ppb認(rèn)為陰性。當(dāng)樣品中軟骨藻酸的含量大于10.0 ppb要稀釋后再測(cè)定。
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