閃晶生物為您提供全套免疫印跡(western blot)技術(shù)服務(wù)和相關(guān)的試劑耗材。主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：

• 蛋白質(zhì)抽提

  • 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。

  • 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品(細(xì)胞培養(yǎng))，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。

2. 蛋白質(zhì)定量：按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。 
3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE):將準(zhǔn)備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)*個(gè)孔中，電泳分離蛋白。 
4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過夜。 
5. western blot膜的封閉和抗體孵育

• 膜在5％脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。

• 封閉過的膜加入一抗室溫孵育1.5小時(shí)，抗原抗體結(jié)合。

• 加入HRP標(biāo)記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜1小時(shí)。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時(shí)檢測GAPDH含量。

6. western blot結(jié)果檢測：化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。 
7. western blot數(shù)據(jù)分析：目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。
8. 提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)。
更詳細(xì)的操作說明 
 Western Blot操作規(guī)程

western blot費(fèi)用：每張膜上做一種目的蛋白和相應(yīng)的內(nèi)參蛋白。每張膜上可以做8個(gè)樣品。每張膜的費(fèi)用是：1500.00元。一抗另計(jì)，其它試劑免費(fèi)，一抗訂購時(shí)間約為3周。乘車路線：火車站坐1號(hào)地鐵到終點(diǎn)站，然后換5號(hào)地鐵坐到北橋站即可。
時(shí)間：約2－3周。
：master@shinegene.org.cn shinegene@vip.163.com ：-11
熒光定量PCR