分光光度法的zui重要的一個物理化學(xué)量是吸光度。為了獲得準(zhǔn)確的研究結(jié)果，準(zhǔn)確測得樣品溶液的吸光度是非常重要的。一般，分析結(jié)果的不可靠性與偶然誤差和系統(tǒng)誤差有關(guān)。偶然誤差影響測量的精密度，可通過足夠數(shù)量測量的統(tǒng)計(jì)處理來減少;系統(tǒng)誤差影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確度，可在大體相同實(shí)驗(yàn)條件下，用比較一種物質(zhì)的準(zhǔn)確測量結(jié)果，使系統(tǒng)誤差統(tǒng)一起來。而分光光度計(jì)的系統(tǒng)誤差(波長校正、分光光度計(jì)的慢散光、放大器的線性響應(yīng)、暗電流和比色皿的光程)和操作誤差(溫度改變、儀器讀數(shù)、操作者的改變、使用物質(zhì)的純度、稱量和濃度、pH)對測量吸光度的影響是可以檢查和校正的。關(guān)于操作誤差，多數(shù)情況下，通過嚴(yán)格按操作程序測量、儀器調(diào)零、準(zhǔn)確稱量等來控制或減少這種誤差的產(chǎn)生。關(guān)于儀器的系統(tǒng)誤差，可通過對分光光度計(jì)的定期校正來克服，若所需準(zhǔn)確度很高的測量，則必須天天校正。
校正內(nèi)容：
1、波長的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 以儀器顯示的波長數(shù)值與單色光的實(shí)際波長值之間誤差表示，應(yīng)在±1.0nm范圍內(nèi)?？捎脙x器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進(jìn)行校正；
2、吸收度的準(zhǔn)確度試驗(yàn)；
3、雜散光的試驗(yàn)；
4、波長重現(xiàn)性試驗(yàn)；
5、分辨率試驗(yàn)。
吸光度的校正方法：
校正吸光度常用一很純物質(zhì)一定濃度的溶液為標(biāo)準(zhǔn)，且此溶液的吸光度系數(shù)經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)室核對，為了使標(biāo)準(zhǔn)液吸光度不受測定波長的微移動而有改變，常選擇具有較平滑吸收高峰的物質(zhì)，同時要求溶液穩(wěn)定，且在相當(dāng)?shù)牟ㄩL范圍內(nèi)吸收度的改變符合Beer-Lambert定律，常用硫酸銅、硫酸銨鈷和硝酸鈉或鉀的溶液。鉻酸鉀溶液是zui常用的標(biāo)準(zhǔn)溶液，此溶液在紫外區(qū)和可見區(qū)均適用。
波長或波數(shù)的校正方法：
可用具有窄吸收帶的溶液，濾光片或蒸氣來校正所需要的光波范圍。如果要求很高的精密度時，可用放電燈泡發(fā)射的射線來校正。有的光譜儀其上已裝有一個為校正用的燈。苯的蒸氣對校正一定范圍的波長亦很有用，可用一小滴苯放于一厘米厚的吸收杯中，測其吸收波長，在遠(yuǎn)紫外區(qū)可用氧氣的吸收帶進(jìn)行校正。用各種稀土金屬的濾光片，可以很快地校正波長，但準(zhǔn)確度不如上述方法高。常用含有鈥和釹、鐠離子的濾光片。
雜散光的校正方法：
小量的雜散光往往會引起較大的測量誤差，它的校正可用一個能*吸收某一波長單色光，且在其他波長吸收很弱的溶液。從這個溶液所表現(xiàn)的透光情況可推測雜散光的近似值。由雜散光帶來的偽吸收帶，亦可用Beer-Lambert定律來檢查，但用此定律檢查偽吸收帶誤差較大。由切斷范圍之外所表現(xiàn)的透射比可得出近似的雜散光百分?jǐn)?shù)。若所含雜散光大于0.1%，應(yīng)設(shè)法減低，或?qū)y得的吸收光度進(jìn)行校正。由雜散光引起的誤差與雜散輻射成正比，因此校正值很容易從化合物的近于正確的曲線計(jì)算而得。此外，還可用一個適當(dāng)?shù)臑V光片，該濾光片在測定波長范圍內(nèi)*透光，但吸收此范圍外的光波，由此來消除雜散光。