1 制備色譜到底是什么？
（1）分析色譜的目的，是分析出混合物中一個(gè)（或者幾個(gè)）純物質(zhì)的含量。制備色譜的目的，是從混合物中得到純物質(zhì)。
    為了加快分離的時(shí)間與提高分離的效率，制備色譜的的進(jìn)樣品量很大，導(dǎo)致制備色譜柱子的分離負(fù)荷的相應(yīng)加大，也就必須加大色譜柱填料，增大制備色譜的直徑和長(zhǎng)度，使用的相對(duì)多的流動(dòng)相。
    然而，當(dāng)色譜柱上樣品負(fù)載加大的時(shí)候，往往導(dǎo)致柱效急劇下降而得不到純的產(chǎn)品。制備色譜，要解決容量與柱子效果之間的矛盾，對(duì)重現(xiàn)性也要考慮。從經(jīng)濟(jì)上來(lái)說(shuō)。制備色譜要爭(zhēng)取少用填料，少用溶劑，要盡可能多的得到產(chǎn)品。
（2）樣品的前處理：
    制備色譜柱子由于處理的樣品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前處理就顯得非常的必要。萃取、過(guò)濾、結(jié)晶、固相萃取等簡(jiǎn)單的分離方法，如果用得上，而且還不是很麻煩，就要盡可能多的采用以去掉雜質(zhì)。
（3）制備色譜柱的材質(zhì)及其特點(diǎn)
    下面介紹一下，制備色譜柱常用的材質(zhì)及其特點(diǎn)。
    各種規(guī)格的玻璃柱子在實(shí)驗(yàn)室里頭很容易得到，而且價(jià)格低廉，但玻璃柱子致命的弱點(diǎn)是它能承受的壓力很小，且非常容易破碎。當(dāng)由于壓力太小而導(dǎo)致流動(dòng)相流速很慢的時(shí)候，高位液面或加高壓空氣（或者氮?dú)猓┑牟捎檬且粋€(gè)簡(jiǎn)單的解決辦法。在底下加真空，也能在一定程度上解決這個(gè)問(wèn)題。
    不銹鋼柱子具有良好的耐腐蝕、抗壓力性能，但其價(jià)格相對(duì)很貴。如果，只有很小的分離任務(wù)且經(jīng)費(fèi)也允許，市面上直徑為1cm的小型制備柱就是。
    有機(jī)玻璃柱子也能抗壓力耐腐蝕，相對(duì)不銹鋼柱子而言，它是半透明的，可以看到液體的運(yùn)行狀態(tài)，對(duì)有色的物質(zhì)其特點(diǎn)就更為突出。
（4）固定相的選擇
    硅膠、鍵合固定相（如C18）、離子交換樹(shù)脂 、聚酰胺、 氧化鋁、 凝膠等都可以作為色譜柱的填料。 有不少文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)填料可以進(jìn)行一下處理提高了分離效果，如，對(duì)硅膠進(jìn)行的硝酸銀（或緩沖液）處理。
（5）裝柱方法的選擇：根據(jù)固定相顆粒度和柱子的尺寸，采用不同的裝柱方法，往往裝填越好分離效果越好。裝柱效果跟填料的顆粒度關(guān)系很大，顆粒度的減少會(huì)導(dǎo)致裝柱的難度。一般來(lái)說(shuō)，顆粒直徑小于20－30um的固定相采用濕法裝填。所謂“敲擊－裝填”技術(shù)適用于顆粒直徑大于25um的固定相。濕法的目的是迫使相對(duì)稀松的 固定相懸漿以高速裝入色譜柱子，從而減少空隙的形成。然而，當(dāng)柱直徑大于20mm，所加壓力為30－40bar時(shí)，高壓懸漿裝填技術(shù)就變得十分復(fù)雜。為將小顆粒固定相裝入更大得制備型色譜柱，可采用柱長(zhǎng)壓縮技術(shù)。這種方法，先將固定相懸漿（或偶爾是干填充物）裝入柱中加壓，利用物理方法將其壓緊。壓緊的方法有兩種：徑向壓縮和軸向壓縮。 濕法裝柱需要一定的設(shè)備，在柱子填完后，應(yīng)用有柱效的測(cè)量，對(duì)柱效低的柱子應(yīng)該重填。
（6）流動(dòng)相的選擇
    除了和分析色譜同樣的考慮外，在選用流動(dòng)相時(shí)，要考慮色譜分離后面加有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等二次分離操作。一般來(lái)說(shuō)，不宜采用高毒性溶劑，對(duì)多元溶劑要盡可能的少用。
    如果產(chǎn)品中含有大量溶劑，溶劑的純度也要考慮在其中。
（7）加樣的方法
    可以采用以下方法之一進(jìn)樣。－用注射器進(jìn)樣－用旋轉(zhuǎn)閥進(jìn)樣－通過(guò)六通閥進(jìn)樣－通過(guò)主泵進(jìn)樣－通過(guò)輔泵進(jìn)樣－固體上樣
（8） 泵的選用
    生產(chǎn)制備色譜泵的廠商很多。根據(jù)有無(wú)脈沖、能承受的zui大壓力、控制的精度、售后服務(wù)等來(lái)選擇泵。
（9）檢測(cè)器的選用
    一般的分析池的zui大允許流速僅為5 mL/min 或者10mL/min。而專門的制備池的zui大允許流速可為150mL/min。有時(shí)，采用旁路分離管，將少量流體導(dǎo)入分析池進(jìn)行檢測(cè)，是一個(gè)不錯(cuò)的辦法，但其濃度的誤差會(huì)相對(duì)較大。
（10）組分保留時(shí)間的估計(jì)
    用分析柱子在同等色譜條件下（同樣的固定相和流動(dòng)相）測(cè)定保留時(shí)間后，按照單一組分的線流速（不是體積流速）一定，通過(guò)計(jì)算可以知道組分的大致保留時(shí)間區(qū)域。
    分析譜圖的峰形狀，對(duì)確定保留時(shí)間也有很大的參考價(jià)值。
（11）產(chǎn)品的收集
    手工餾分收集費(fèi)時(shí)費(fèi)力，自動(dòng)餾分收集器有很大的方便。許多實(shí)驗(yàn)室和工廠都采用了餾分收集器。
（12）超載、邊緣切割、中心切割、放大技術(shù)與非線性效用
    在制備色譜中，因?yàn)闆](méi)有必要達(dá)到分析色譜那樣的分離度，可以在一定范圍內(nèi)大大加大進(jìn)樣的濃度和體積。在做分離的時(shí)候，也有一些分析色譜的時(shí)候，不能用到的技巧。因?yàn)槠P(guān)系，不在這里敘述。
（13）柱轉(zhuǎn)換技術(shù)
    通過(guò)接頭或者閥門，實(shí)現(xiàn)柱子的簡(jiǎn)單延長(zhǎng)，或者比較方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)其中一個(gè)（或幾個(gè)）組分的精制。
（14）比較新的制備色譜技術(shù)
    模擬移動(dòng)床可以連續(xù)進(jìn)樣，并可以利用邊緣切割效用，而且采用了柱切換技術(shù)，能更好的利用溶劑和填料，已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。其理論和技術(shù)也日益*。
    迎頭色譜、超臨界流體色譜、逆流色譜環(huán)形色譜、氣相制備色譜等在科研和工業(yè)生產(chǎn)中也得到了應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)：
1 問(wèn): 我想購(gòu)買waters600用于分析和制備，對(duì)于其配備有什么好的建議。
答：可以配一個(gè)PDA，另外加一個(gè)示差折光410，另外買幾根制備柱就可以了。waters600的流速zui大為20mL/min，一般可以配20mm ID的制備柱，一次分離10-100mg的樣品，如果樣品量更大，可以通過(guò)配件擴(kuò)展到45mL/min，使用30mm ID的制備柱。另外為了保證餾分收集的準(zhǔn)確性，配上Fraction II 餾分收集器。
    如果樣品數(shù)量很大，可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同時(shí)做自動(dòng)進(jìn)樣并通過(guò)MS或U號(hào)自動(dòng)收集餾分。這樣可以過(guò)夜自動(dòng)運(yùn)行。zui大通量每天可以處理100-200個(gè)樣品。

2 問(wèn)： 如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？
    制備色譜柱為Zorbax SB-C18 9.4*250mm及gilson餾分收集器，色譜儀為Agilent 1100或LC-6A。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進(jìn)行定性分析。如何設(shè)定色譜條件，如流量，進(jìn)樣量，樣品的濃度，切割點(diǎn)的設(shè)置，是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除。（主峰后有二個(gè)雜質(zhì)靠得很近。）
答：制備用的流動(dòng)相等級(jí)高一點(diǎn)，否則流動(dòng)相中的雜質(zhì)會(huì)影響LC-MS分析；使用餾分收集器時(shí)，延遲體積一定要計(jì)算，檢測(cè)器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)到zui小，否則都會(huì)影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min，9.4mm制備柱用1*（9.4/4.6）2, 大約為4ml/min。進(jìn)樣量設(shè)到幾個(gè)mg應(yīng)該基本沒(méi)有過(guò)載。進(jìn)樣樣品濃度越高越好。假如進(jìn)樣10mg，理論計(jì)算0.05%的雜質(zhì)大約只有5ug，顯然濃度太低，是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。

3 問(wèn)： 我想用hplc分離一個(gè)簡(jiǎn)單的多肽,我應(yīng)該選用什么樣的流動(dòng)相,還有他的梯度,還有選用什么樣的柱子
答： RP-HPLC,C18柱可以制備很少量的肽。如果用RP-HPLC，首先應(yīng)該用同類型的分析柱子分析一下多肽含多少雜質(zhì)，設(shè)置緩緩的梯度的分離樣品，在根據(jù)分析柱子跑出的峰形，逐漸放大純化的方法。

4 問(wèn)：TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)pH的作用呢？TFA的濃度越高基線的漂移越厲害，那是不是說(shuō)它的濃度在緩沖液pH允許的情況下越低越好呢？
答：（1）TFA起到類似離子對(duì)的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過(guò)高的濃度，會(huì)使溶液偏酸，長(zhǎng)時(shí)間使用可能影響柱子壽命。
（2）同時(shí)TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時(shí)0.1%TFA分離不好的話。可以考慮加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時(shí)沖洗色譜柱。
（3）走梯度時(shí)，因?yàn)樽叱苫€漂移，但對(duì)制備的影響不大。

5 問(wèn)：樣品如果溶解度太低如何上制備HPLC？
答（1） 了解一下樣品的性質(zhì),根據(jù)其酸堿性,極性等性質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)溶劑的pH值等, 以達(dá)到較好的溶解度
（2）樣品可能某種晶型難溶，這樣可以加入其他溶劑（如丙酮等）以助溶。
（3）不是一定要用流動(dòng)相來(lái)溶解樣品，對(duì)溶解度差的樣品，可以選擇甲醇，THF或DMSO等溶解樣品。特別是DMSO，對(duì)一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不會(huì)造成干擾。而且DMSO的洗脫能力很弱，一般不會(huì)影響峰型。
（4） 可以固體上樣。

6 問(wèn)：多肽的分離制備, 如何上量？如何增大分離度?
答：反相HPLC應(yīng)當(dāng)是很好的分離小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流動(dòng)相，看保留如何，若無(wú)保留，建議改用其他色譜方法進(jìn)行分離。
    關(guān)于多肽的分離，首先要知道它的分子量大小，然后選擇不同類型的填料，如孔徑的大小。我們先在分析柱（4.6MM內(nèi)徑）上做一下實(shí)驗(yàn),找到zui大的分離度,這一過(guò)程的難度是zui大的,要不斷地改變流動(dòng)相和固定相,然后再線性或非線性放大到制備,放大的倍數(shù)按分析柱的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分離后可以通過(guò)冷凍干燥得到固體。
    還可以考慮離子交換來(lái)分l離

７問(wèn)： 做柱層析時(shí)（國(guó)產(chǎn)大孔吸附樹(shù)脂），怎么才能把洗脫液中的樹(shù)脂殘留物處理干凈？
答：大孔吸附樹(shù)脂在上使用前，一般需要進(jìn)行處理，方法包括用色譜純的甲醇或乙睛洗到?jīng)]有吸收；或樹(shù)脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常規(guī)的酸，堿洗。再用丙酮回流二小時(shí)就可以用了。

8 問(wèn)：由分析型液相轉(zhuǎn)為制備型液相，其色譜系統(tǒng)需作多大調(diào)整？是否可以按照柱體積折算只改變流速？其上樣量多大為宜？
答：（1）泵要換，流量要加大，壓力可不變或減少；流通池要換體積更大的。
（2）整個(gè)系統(tǒng)的管路要更換更粗的，否則壓力太大,而且特別容易發(fā)生堵塞。對(duì)流通池后的管路，增加反壓調(diào)節(jié)器，否則管路太短的話，反壓小會(huì)導(dǎo)致流通池氣泡，管路長(zhǎng)的話會(huì)導(dǎo)致峰展寬。
（3）檢測(cè)器的響應(yīng)時(shí)間和峰寬要設(shè)置合適，否則會(huì)導(dǎo)致收集時(shí)延遲體積的計(jì)算不準(zhǔn)
（4）上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度、制備是否根據(jù)分析條件放大（例如制備柱是否還用分析用填料）；一般上樣量與柱子直徑的平方以及長(zhǎng)度成正比。

9 問(wèn)：流動(dòng)相中含有鹽時(shí)，收集液該如何除鹽？選用揮發(fā)性酸，堿或鹽（如醋酸銨）是否會(huì)在揮干溶劑或凍干過(guò)程中直接除去？
答：一般可以采用離子吸附的辦法去掉（可以參考離子吸附有關(guān)技術(shù)）。但也是稍微麻煩的事情，，不加加酸堿鹽，如果要加的話，要加揮發(fā)性的或者對(duì)產(chǎn)品或者檢測(cè)沒(méi)有干擾的。
    可用G25脫鹽，它是安馬西亞出的一種葡聚糖凝膠。交聯(lián)度大孔徑小,對(duì)小分子的無(wú)機(jī)鹽保留較大,而對(duì)分子量較大的有機(jī)物沒(méi)有保留從而可以將鹽份脫除。另外采用揮發(fā)性的酸，堿時(shí)，一般會(huì)在干燥過(guò)程中直接除去，但如果樣品也有酸堿性，可能會(huì)與這些揮發(fā)性酸堿形成一定比例的鹽。

10 問(wèn)：制備型柱子柱壓上升 柱效下降 怎么辦？
答：對(duì)高價(jià)值的制備柱來(lái)講，延長(zhǎng)柱子壽命是很重要的。一般要注意保護(hù)柱子，一般來(lái)說(shuō)，制備柱子一般需要保護(hù)柱配套。
    下面是可能堵塞柱子的原因
（1） 如果您所分離的樣品中雜質(zhì)較多而您在上樣前沒(méi)有經(jīng)過(guò)過(guò)濾（0.45微米），一些顆粒性雜質(zhì)會(huì)積聚在柱頭造成柱壓升高，
（2） 也有可能是因?yàn)槟褂玫牧鲃?dòng)向中含有緩沖鹽的原因，結(jié)晶或發(fā)生化學(xué)變化而堵塞。可以把柱子沖一沖。
（3） 流動(dòng)相是否符合液相色譜的要求？是否過(guò)濾處理？

    柱子再生處理辦法如下：
（1）依次用水，甲醇，*，氯仿，甲醇來(lái)沖洗柱子，每種溶劑5-10個(gè)柱體積。
（2）如果效果不明顯，將柱子按以上順序反沖，一般將大大降低柱子效果，不到不要沒(méi)有辦法才采用。
（3）如果效果還是不好，就需要打開(kāi)色譜柱，超聲波清洗篩片（這樣也會(huì)使柱子效果下降）。必要時(shí)挖掉色譜柱內(nèi)受污染部位，填入新的填料，還可用3個(gè)月。（填的時(shí)候小心，別重新污染柱子）

11 問(wèn)：制備柱柱跑干了影響柱效嗎?
答：如果時(shí)間不長(zhǎng)的話,可以用流動(dòng)相多沖幾個(gè)小時(shí).柱效不一定變化很大.如果時(shí)間太久,柱效一定變低. 具體造成影響有多大，要靠柱效測(cè)定來(lái)確定，而不是干柱時(shí)間的長(zhǎng)短。如果跑干了，對(duì)于PUMP的影響可能還大些，所以先把管路中的空氣抽走再說(shuō)。
    一般說(shuō)來(lái)，制備柱子跑干，屬于操作失當(dāng)。柱子閑置不用時(shí)，沖入甲醇或其他有機(jī)溶劑，一定要把兩頭堵住密封，這樣保留的時(shí)間會(huì)較長(zhǎng)。

12 問(wèn)：分析HPLC如何放大到制備型HPLC
答：在分析液相中色譜柱的典型進(jìn)樣量是微克級(jí)，甚至更低。樣品量和固定相之比有的甚至小于1:10000。進(jìn)樣體積一般來(lái)說(shuō)都大大小于色譜柱體積（小于1:100）。 在這種條件下，會(huì)達(dá)到很好的分離效果，峰形尖銳并且很對(duì)稱。
    分析系統(tǒng)線形放大到制備型HPLC意味著使用直徑更大的制備柱、更高的流速和根據(jù)色譜柱的長(zhǎng)度增加進(jìn)樣量并保持樣品濃度不變。峰形仍會(huì)保持尖銳而對(duì)稱。這種方法需要大型的色譜柱和大量的溶劑來(lái)分離較少的樣品，但這種方法從經(jīng)濟(jì)上一般不合適。
    在制備液相中，zui大的區(qū)別就是超量進(jìn)樣。制備的分離峰形一般不可能仍會(huì)保持尖銳而對(duì)稱，分析和制備是不同的概念。制備的首要概念是在達(dá)到純化的基礎(chǔ)上，降低成本，加快時(shí)間（提率）。一般說(shuō)來(lái)，純化的成本要高于生產(chǎn)粗產(chǎn)品的成本，所以，可以加大上樣量，甚至過(guò)載，出現(xiàn)平頭峰，而收集只集中在峰的一小部分，以來(lái)保證純度，主要為了節(jié)省流動(dòng)相和提高設(shè)備利用率。

13 問(wèn)：制備純化蛋白、多肽，耗用流動(dòng)相驚人，請(qǐng)問(wèn)這些用過(guò)的流動(dòng)相（乙腈，甲醇）可以重蒸使用嗎？
答：流動(dòng)相用一般減壓方法重蒸后，往往會(huì)形成有機(jī)溶劑和水會(huì)共沸，另外，由于減壓蒸餾屬于單次平衡，往往得不到100%純度的溶劑，這會(huì)使溶劑的配置有一定困難，從而使色譜的重現(xiàn)性和分離度會(huì)發(fā)生一定的變化。如果要求不是很高的話，一般可以分析重蒸后餾分中的各組分含量，計(jì)算后再使用。
    要通過(guò)重蒸得到純物質(zhì)是極其困難的，必須采用精餾塔多級(jí)蒸發(fā)，單就設(shè)備投資和能耗來(lái)講，實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；蛏a(chǎn)規(guī)模的廢液回收處理已經(jīng)是得不償失。其實(shí)，我們沒(méi)有必要得到純的物質(zhì)。

14 問(wèn)：反相色譜分離純化后，怎樣除去流動(dòng)相產(chǎn)品中的TFA和乙腈或其他雜質(zhì)？
答： TFA是反相色譜分離中常用的添加劑?？梢杂脙龈傻霓k法去除，國(guó)外許多文獻(xiàn)是這樣報(bào)道的。還可以試試離子交換、凝膠層析、甚至透析和超濾，其中，離子交換層析效果比較好，還可以起到濃縮樣品的作用。
首先，凍干的辦法應(yīng)該可以幾乎*地除去TFA和乙腈，藥物實(shí)驗(yàn)前先檢測(cè)一下凍干品中的殘留量，只要不超過(guò)允許范圍，這種辦法是zuizui簡(jiǎn)單、有效的。
    其次，如果你的藥物的分裝量不大的話（<100ug），建議你用離子交換層析，裝一個(gè)小一點(diǎn)兒的柱子，讓含鹽洗脫峰的蛋白濃度達(dá)10mg/ml以上，稀釋后*符合試驗(yàn)要求。如果用分子篩，考慮稀釋，也先過(guò)一個(gè)離子交換。此外可以試試疏水層析。如果產(chǎn)品是堿的話，可能會(huì)形成TFA鹽，這樣通過(guò)上述方法就無(wú)法除去。一般可以用堿水洗，然后將產(chǎn)品萃取出來(lái)?；蛘咴诶锩婕尤胍欢康柠}酸，再干燥后形成鹽酸鹽。

15 問(wèn)：同一種填料的分析柱、制備柱按線形放大公式套，分離度會(huì)不會(huì)變化？
答：一般會(huì)有一定的變化，原因有以下幾點(diǎn)
（1） 制備柱的裝填是否均勻，如不均勻則可能產(chǎn)生渦流擴(kuò)散使各個(gè)組分的經(jīng)過(guò)通道的直徑不同、阻力不一樣，停留時(shí)間不同，色譜峰可能變寬。
（2） 如果樣品在流動(dòng)相中溶解度小，在制備色譜上會(huì)有不同的峰展寬。
（3）如果樣品在分析柱上有展寬或拖尾的現(xiàn)象，放大到制備柱上后峰的展寬和拖尾經(jīng)常會(huì)非常嚴(yán)重，導(dǎo)致分離失敗。

16 問(wèn)：制備色譜柱如何測(cè)柱效？
答：可以選擇幾種物質(zhì)，苯，甲苯，萘、蒽等的衍生物上柱，流動(dòng)相一般用65-80%的甲醇/水，測(cè)定后根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算塔板數(shù)。由于制備色譜的管路死體積一般比較大，很難得到和供應(yīng)商相同的柱效。建議在制備柱開(kāi)始使用時(shí)在自己的色譜上測(cè)一下柱效，然后定期檢測(cè)柱效進(jìn)行以進(jìn)行比較。

17 問(wèn)：反相色譜分離后，如何快速?gòu)牧鲃?dòng)相中得到產(chǎn)品？
答：可以考慮先在低溫下，減壓旋蒸除去其中的有機(jī)溶劑，然后用萃取的方法（如乙醚、氯仿萃取等）把產(chǎn)品萃取出來(lái)，然后再低溫再旋蒸，這樣，就可以不將溫度升得很高而得到產(chǎn)品。
    如果要直接蒸掉流動(dòng)相，水泵的真空度要注意（要檢查氣密性），否則蒸水會(huì)很慢。一般比較好的泵在60-70度即可蒸掉水，如果泵的真空度不好，可能需要80-90度才行，這樣容易暴沸導(dǎo)致樣品損失。另為，溫度太高可能引起物質(zhì)變性。