核酸提取儀"的原理

核酸提取儀的工作原理

目前核酸提取儀的工作原理主要分為磁珠法和柱法，其中磁珠法占據(jù)當(dāng)前市場(chǎng)的主流地位。

磁珠的工作原理主要是利用磁珠對(duì)核酸的特異性識(shí)別和高效結(jié)合，通過磁珠吸附核酸達(dá)到分離效果。常見的磁珠類型包括氧化鋯磁珠和二氧化硅磁珠。根據(jù)磁珠與液體的分離方法，提煉出磁選機(jī)法和抽吸法，其原理和過程相同。

核酸提取儀"的分類

根據(jù)不同類型的儀器。

1)自動(dòng)液體工作站

自動(dòng)液體工作站是一個(gè)非常*的設(shè)備，它可以自動(dòng)分配和吸取液體，甚至通過集成擴(kuò)增和檢測(cè)功能，實(shí)現(xiàn)標(biāo)本提取、擴(kuò)增和檢測(cè)的全自動(dòng)化。提取核酸只是其功能的一個(gè)應(yīng)用，不適合常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室提取核酸。一般適用于單一種類標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)要求，一次可抽取非常大量的標(biāo)本(至少96個(gè)，一般為數(shù)百個(gè))。自動(dòng)化工作站平臺(tái)的建立和運(yùn)行需要相對(duì)較大的資金。

2)小型自動(dòng)核酸提取儀

小型自動(dòng)化儀器通過操作結(jié)構(gòu)的特殊性，可以自動(dòng)提取核酸，可以應(yīng)用于任何實(shí)驗(yàn)室。

根據(jù)不同的提取原理。

1)儀器采用離心柱法

離心柱法核酸提取儀主要采用離心機(jī)和自動(dòng)移液裝置相結(jié)合的方法。通量一般為1-12個(gè)樣品，操作時(shí)間與人工提取幾乎相同。不能提高實(shí)際工作效率，而且貴。不同類型儀器的耗材不能通用，只適合資金充足的大實(shí)驗(yàn)室。

2)使用磁珠法的儀器

以磁珠為載體，基于磁珠在高鹽低PH值下吸附核酸，在低鹽高PH值下與核酸分離的原理，通過移動(dòng)磁珠或轉(zhuǎn)移液體即可實(shí)現(xiàn)核酸提取純化的全過程。由于其原理的*性，可以設(shè)計(jì)成多種通量，單管或8-96個(gè)樣品即可提取。而且其操作簡(jiǎn)單快捷，提取96個(gè)樣品僅需30-45分鐘，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率，成本低廉。因此可以在不同的實(shí)驗(yàn)室使用，是目前市場(chǎng)上的主流儀器。

根據(jù)工作性質(zhì)。

1)手工提取核酸存在操作步驟復(fù)雜、效率低、核酸純度低等問題。

2)全自動(dòng)核酸提取是利用匹配的核酸提取試劑快速提取樣品核酸，具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。在此疫情中，高通量自動(dòng)核酸提取儀在大規(guī)模人群核酸檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。

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“核酸提取儀"的應(yīng)用

核酸提取儀是生物分子相關(guān)分離純化實(shí)驗(yàn)室中非常重要的儀器，可廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、疾病控制和醫(yī)療、臨床診斷、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域。

1.基因組學(xué)

無論提取樣品的來源是微生物、動(dòng)物、植物還是病毒，核酸提取儀結(jié)合試劑盒可以快速純化足夠數(shù)量和純度的DNA或RNA。高質(zhì)量的核酸可以滿足下游應(yīng)用的需要(如PCR/實(shí)時(shí)PCR、基因芯片、Southern印跡和Northern印跡)。

2.疾控中心疾病預(yù)防控制

基于全自動(dòng)核酸提取儀的快速高通量技術(shù)，可用于解決甲型H1N1流感、兒童手足口病、麻疹病毒等的快速自動(dòng)化疫情監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。，提高重大疫情的應(yīng)對(duì)能力。

3.臨床樣本的分子診斷

該核酸提取純化系統(tǒng)能夠快速、高通量地處理臨床樣本，提取的核酸可用于后續(xù)的分子診斷。它也適用于福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE)的組織樣本。

4.畜牧獸醫(yī)

它能高效、靈敏地提取新城疫病毒、豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒、貝氏柯克斯體等。

5.法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用

對(duì)于法醫(yī)工作來說，核酸提取的效率和穩(wěn)定性非常重要。核酸提取儀與法醫(yī)樣本核酸提取專用磁珠試劑配合使用時(shí)，可從包括煙頭、發(fā)根、軟骨、指甲等不同來源的材料中純化出高質(zhì)量的DNA。

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“核酸提取儀"常見問題及解決方法

1.磁棒核酸提取儀手工提取與電腦提取有顯著差異。

磁棒式核酸提取儀通常使用磁性保護(hù)套(攪拌套)轉(zhuǎn)移磁珠并均勻混合液體，深孔板底部使用加熱模塊加熱深孔板孔內(nèi)液體，從而模擬人工操作過程。手工提取的實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能說明手工操作過程和試劑光環(huán)沒有問題，轉(zhuǎn)到儀器后要綜合考慮。

磁珠法的一般操作流程:裂解、結(jié)合、洗滌、洗脫可在手工操作中分步實(shí)現(xiàn)。但為了限度避免人工操作，通常在一個(gè)孔內(nèi)進(jìn)行破解和組合?？蛻粢话闶褂镁凭鳛檎辰右?，不僅稀釋了裂解液，也影響了裂解效率。而且由于孔內(nèi)液體溫度上升，酒精揮發(fā)影響鍵合效率。另外，儀器一般采用底部加熱方式，孔內(nèi)溫度無法以儀器設(shè)定溫度為準(zhǔn)，不同廠家的儀器加熱效率也會(huì)有所不同。所以光這一步就要在電腦上優(yōu)化系統(tǒng)。

2.磁棒核酸提取儀孔位置提取效率不同。

磁條型核酸提取儀一般用卡片或黃色鋼球固定96孔深孔板，底部有槽形加熱片。在進(jìn)行加熱條件下的實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果深孔板的孔與底部的加熱槽沒有緊密貼合，會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這種安靜的情況導(dǎo)致了孔間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定。如果發(fā)現(xiàn)一個(gè)固定孔的提取結(jié)果總是與其他孔有較大差異，可以考慮儀器的加熱模塊是否有問題，觀察該孔的上游裂孔是否有磁珠殘留，用空白樣品檢查儀器在孔間的磁珠轉(zhuǎn)移能力是否*。

3.磁棒核酸提取儀機(jī)器提取中加入的洗脫液體積與實(shí)際獲得的核酸溶液體積不同。

目前市場(chǎng)上的磁棒核酸提取儀加熱模塊大多位于96孔深孔板的一、六、七、十二排。一排和七排大部分用作裂解和結(jié)合孔，而第六排和第十二排用作洗脫孔。因?yàn)榇蟛糠州腿?shí)驗(yàn)在裂解結(jié)合步驟中需要加熱，而第六排與第七排相鄰，由于熱傳導(dǎo)效應(yīng)的存在，使得熱解加熱時(shí)第六列洗脫液的溫度也會(huì)升高，從而導(dǎo)致洗脫液的蒸發(fā)。因?yàn)橄疵撘旱捏w積很小(50μL-200μL)，所以實(shí)際得到的核酸溶液的體積與加入的洗脫液系統(tǒng)的體積相差很大。

4.提取的核酸產(chǎn)量低。

A.樣品體積與試劑的比例應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)，以免超過裂解能力。

B.粉碎和研磨的步驟。處理細(xì)節(jié)很重要。必須充分研磨，這是提取核酸的條件。

c、在洗脫步驟中，使用足夠的洗脫劑進(jìn)行洗脫并充分混合，以避免wjdtpod殘留結(jié)塊。

D.實(shí)驗(yàn)耗材要配套。比如不同的吸附柱或磁珠對(duì)核酸的吸附能力不同，也會(huì)影響核酸的產(chǎn)量。

5.提取的核酸被降解。

A.提取的樣品量應(yīng)符合試劑的比例，并盡量控制樣品量達(dá)到適當(dāng)?shù)谋壤?/p>

B.注意每一步都要充分均勻的混合，避免結(jié)塊的殘留影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

C.在洗脫過程中，如果時(shí)間太長(zhǎng)或溫度太高，核酸可能會(huì)降解。

D.切記樣品不要反復(fù)凍融，提取的樣品要保存在適宜的溫度下，長(zhǎng)期保存盡量在-80℃。

6.提取的核酸純度不夠高。

A.樣品量和試劑如裂解物的比例應(yīng)盡可能控制在合適的范圍內(nèi)。

B.攪拌均勻，保證充分開裂，無塊狀殘留物。

C.干燥的步驟要充分，否則可能會(huì)導(dǎo)致酒精等雜質(zhì)的殘留。

D.如果磁棒的振蕩幅度過小或混合時(shí)間過短，磁珠上的雜質(zhì)殘留會(huì)影響磁珠吸附核酸的能力。

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“磁珠核酸提取儀"的常見誤區(qū)

誤區(qū)一:磁珠用的越多，提取效果會(huì)越好。

很多老師喜歡在提取效果差的時(shí)候加大磁珠的量。他們認(rèn)為更多的磁珠可以吸附更多的核酸。不得不說，這種想法是不可取的。

磁珠的主要特點(diǎn)是在外加磁場(chǎng)的作用下，能以固態(tài)分散在液體中或從液體中分離出來。任何試劑體系，磁珠與液體的比例都應(yīng)該有一定的閾值。如果超過一定的比例，太多的磁珠會(huì)失去分散特性，因?yàn)樗鼈儾荒芫鶆蚍稚⒃谝后w中，在洗滌過程中核酸磁珠和液體之間的接觸效率不能充分增加。過多的磁珠也會(huì)吸附更多的雜質(zhì)，對(duì)除雜效果影響很大。有時(shí)，過多的磁珠會(huì)吸附液體體系中起主要作用的蛋白酶、溶菌酶等功能成分，導(dǎo)致整個(gè)試劑盒效率低下。在很多情況下，當(dāng)提取效果不好時(shí)，減少磁珠的用量是提高提取效果方法。

通常磁珠法試劑盒給出的參比磁珠量略過量，需要增加磁珠量以提高吸附效率的情況并不多。但是，如果確定由于磁珠量不足導(dǎo)致提取效果不好，則可以通過在一定范圍內(nèi)增加磁珠量來提高提取效果。

以GNT-02系列磁珠為例，提取常量樣品(植物組織、全血等)時(shí)。)，通常用量為10ul/次；提取微量樣本(如血清游離DNA、口腔拭子等)時(shí)。)，磁珠量應(yīng)在15~20ul/次。如果需要超過這個(gè)使用量，需要和技術(shù)工程師溝通。

誤區(qū)二:使用的試劑越多，提取效果越好。

破解效果不好？添加更多的裂解溶液。洗滌效果不好？添加更多洗滌液。這是很多客戶在使用套件時(shí)的習(xí)慣思維。

但是對(duì)于磁珠法來說，每增加一部分液體體積，磁珠的碰撞幾率就會(huì)降低，降低磁珠的碰撞幾率會(huì)導(dǎo)致吸附率的大幅下降。所以在很多情況下，雖然增加裂解液和洗滌液確實(shí)可以增強(qiáng)裂解和洗滌，但磁珠提取的核心是磁珠吸附核酸的效率，不保證磁珠的碰撞效率就無法保證核酸提取的效率。因此，簡(jiǎn)單地增加用于改善提取效果的試劑的量可能不是*有效的。

對(duì)于GNT-B02全血基因組DNA試劑盒，裂解液和洗滌液的量分別不得超過400微升/次和500微升/次。如果真的需要對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行放大，那么磁珠和樣品的量也要相應(yīng)增加，而且這個(gè)放大不一定是成比例的。

誤區(qū)三:洗滌次數(shù)越多，萃取效果越好。

當(dāng)提取的核酸中雜質(zhì)過多時(shí)，用戶會(huì)考慮多洗幾次，以獲得更純的核酸。增加洗滌次數(shù)確實(shí)有利于核酸的純化，但考慮到每次洗滌都會(huì)損失一定量的核酸，增加核酸裂解和水解的可能性，一般將洗滌次數(shù)控制在2~4次為宜。

對(duì)于GN系列試劑盒，單個(gè)凈化試劑盒洗滌次數(shù)為2次，植物和動(dòng)物試劑盒洗滌次數(shù)為3次，血液試劑盒洗滌次數(shù)為3~4次。

誤區(qū)四:取樣越多，提取效果越好。

當(dāng)樣品不夠新鮮或者核酸含量本身較少時(shí)，核酸提取效果往往較差，很多老師會(huì)通過多取樣品來增加核酸提取量。

但單純?cè)黾訕悠妨坑袝r(shí)會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)過多，超過裂解液的裂解能力，降低提取效率。因此，不建議單純?cè)黾訕颖玖縼磉_(dá)到增加提取量的目的。

如果由于樣品量不足，提取量確實(shí)太低，建議在開始提取前進(jìn)行富集或濃縮步驟?；蛘咴黾忧懈畹?性以暴露更多的核酸也是一種解決方案。

誤區(qū)五:如果某一種磁珠是好的，那么它應(yīng)該在所有實(shí)驗(yàn)中都很好用。

磁珠的種類很多，不同的粒徑、不同的分散性、不同的磁響應(yīng)時(shí)間、不同的包被基基質(zhì)、不同的外部修飾官能團(tuán)、不同的包被密度、不同的官能團(tuán)臂長(zhǎng)，都會(huì)導(dǎo)致磁珠的特性不同。

所以不同的磁珠所適應(yīng)的實(shí)驗(yàn)和系統(tǒng)是不一樣的。就像同樣一種提取核酸的試劑，配方不*一樣，用于提取核酸的磁珠性質(zhì)也不*一樣。

有些磁珠在提取大核酸時(shí)表現(xiàn)出更高的吸附效率，有些磁珠更適合提取微量核酸。有些磁珠適用于酸性試劑體系，有些磁珠適用于堿性試劑體系。有些磁珠磁響應(yīng)好但沉降速度快，比較適合磁棒自動(dòng)提取儀；有些磁珠沉降速度慢，但磁響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，更適合移液自動(dòng)提取儀。

少數(shù)幾種磁珠可以用于所有實(shí)驗(yàn)。除了固定的試劑盒，在大多數(shù)情況下，磁珠和試劑系統(tǒng)必須調(diào)整一段時(shí)間。

誤區(qū)六:與某個(gè)套件相比，效果不好，就是磁珠不好。

很多客戶在篩選磁珠的過程中，只是在成熟的試劑體系下，簡(jiǎn)單的更換等量的磁珠，來比較磁珠的效果。

這樣很容易得出某些磁珠效果不好的結(jié)論，但實(shí)際上由于不同的磁珠適用于不同的體系和劑量，往往需要調(diào)整才能得到更好的提取效果。

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購買“核酸提取儀"

核酸提取儀常見的核心參數(shù)有:提取原理、機(jī)械原理、提取時(shí)間、樣品通量、樣品管容量、針尖頭通量、針尖頭數(shù)、接口、儀器重量、儀器尺寸等。同時(shí)，在購買核酸提取儀時(shí)，除了上述核心參數(shù)外，還需要考慮以下因素:

1.操作簡(jiǎn)單，使用方便。

每次提取時(shí)，操作人員只需做安裝工作，布置孔板(提供提取所需的試劑)。整個(gè)提取過程不需要人工幫助，儀器自動(dòng)完成，并盡可能配置中文界面，有利于學(xué)習(xí)儀器的使用和編輯程序，減少新操作人員的誤操作，降低實(shí)驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)。

2.高吞吐量、速度和便利性

根據(jù)不同的應(yīng)用場(chǎng)景，可以實(shí)現(xiàn)一次快速處理盡可能多的樣本，在短時(shí)間內(nèi)完成提取，從而保證核酸提取的高效、快速和及時(shí)。

3.安全、環(huán)保、穩(wěn)定、無污染。

操作中涉及的試劑盒和溶劑要盡量低，對(duì)人體無害。

4.低成本和開放平臺(tái)

基于成本考慮，試劑耗材的消耗和供應(yīng)周期在采購時(shí)也要考慮。盡可能選擇適合不同廠家提取的不同規(guī)格耗材和試劑的兼容性高的儀器。