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近日，伊利集團與環(huán)特生物在國際期刊《Plos One》上聯(lián)合發(fā)表題為 《Bifidobacterium lactis BL-99 modulatesintestinal inflammation and functions inzebrafish models 》的文章（February 16, 2022）。

在過去幾十年里，糖的消耗量急劇增加。多項研究表明，糖的過度消耗與腸道通透性的改變和代謝疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

乳雙歧桿菌BL-99是伊利集團的專有菌株，已被商業(yè)化用于酸奶、冰淇凌、零食等產(chǎn)品。本研究旨在探討伊利這種獲得zhuanli的、具有耐胃酸和耐腸液性能的益生菌乳雙歧桿菌(bifidobacteriumlactis)BL-99，在斑馬魚模型中對腸道炎癥和功能的治療作用和機制。

該研究基于斑馬魚實驗表明，BL-99或可緩解由不規(guī)律高糖引發(fā)的腸道炎癥，并改善腸道功能，為BL-99的功效潛力提供了新證據(jù)。

● 乳雙歧桿菌BL-99

雙歧桿菌是由法國學者初次分離出的一種厭氧革蘭氏陽性桿菌，末端常常分叉，因此稱為雙歧桿菌。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并測序幾十種雙歧桿菌，包括動物雙歧桿菌 (B.animals)、長雙歧桿菌(B.longum)和短雙歧桿菌(B.breve)等。

雙歧桿菌在人體腸道內(nèi)是時刻變化的，嬰幼兒時期，腸道內(nèi)雙歧桿菌較多，但隨著年齡的增加，雙歧桿菌逐漸減少。在整個生命歷程中，腸道內(nèi)的雙歧桿菌維持著動態(tài)平衡，這對于腸道正常功能的發(fā)揮及人體健康是至關(guān)重要的。

乳雙歧桿菌BL-99,是一株由內(nèi)蒙古伊利有限責任公司自主研發(fā)的益生菌。分離自中國健康嬰幼兒腸道，在中國科學院微生物所菌種保藏中心CGMCC進行zhuanli寄存，保藏號為CGMCC156502-4。

乳雙歧桿菌BL-99無抗生素耐受，無抗生素轉(zhuǎn)移風險；毒理學評價表明BL-99無急毒、亞急毒特性，無體內(nèi)轉(zhuǎn)移風險，屬于具有較高安全等級的益生菌菌株。乳雙歧桿菌BL-99，已作為功能性食品成分用于伊利集團的各類產(chǎn)品，例如酸奶、營養(yǎng)補劑、冰淇淋等。

乳雙歧桿菌BL-99，在改善腸道炎癥、促進消化、調(diào)節(jié)免疫力、骨骼健康等方向得到了較好的科學驗證。BL-99具有較好的耐酸能力、耐膽鹽特性，可在腸道內(nèi)保持活菌特性。

● 斑馬魚研究結(jié)果

斑馬魚（Danio rerio）的腸道成分與人類相似，如結(jié)締組織、外縱肌和環(huán)形肌等。隨著動物福利“3R原則（Reduction, Replacement, Refinement）"的實施，斑馬魚已被用作篩選腸道益生菌的替代模式生物。

研究發(fā)現(xiàn)，乳雙歧桿菌BL-99能夠在斑馬魚腸道中留存超過24h，促進腸道蠕動，有效緩解硫酸鋁引起的便秘癥狀 ( p< 0.01)；

不規(guī)律高糖飲食，易誘發(fā)斑馬魚腸道功能和代謝紊亂；

為腸道功能和代謝紊亂的斑馬魚喂食乳雙歧桿菌BL-99后，其IL-1β的基因表達顯著下調(diào)，IL-10、IL-12基因水平顯著上調(diào)（p < 0.05），腸道脂肪酶活性提高，但未發(fā)生明顯變化( p > 0.05)；

組織病理學與代謝組的分析表明，BL-99改善了斑馬魚腸道炎癥，杯狀細胞數(shù)量增加，其代謝物水平恢復；

BL-99或可通過調(diào)節(jié)斑馬魚的腸道和微生物代謝，來緩解腸道炎癥和改善腸道功能。

● 實驗結(jié)論

1. 斑馬魚幼魚的研究

如圖1A 和 1B 所示，在喂食BL-99后的2h、6h和24h，斑馬魚幼魚腸道熒光強度分別為6.02±0.866、10.7±1.08和13.0±0.601像素。比較24小時和2小時的熒光強度，p < 0.001，但比較24小時和6小時的熒光強度時，p >0.05，表明乳雙歧桿菌BL-99在喂食6小時后有效地保留在斑馬魚的腸道中。

圖1. 斑馬魚腸道中的乳雙歧桿菌BL-99保留和持續(xù)時間段

對腸蠕動和便秘的治療作用

如圖2B和2C所示，正常斑馬魚腸道的熒光強度為403493±37456像素，硫酸鋁處理斑馬魚腸道熒光強度為517757±11985像素（p < 0.01），說明斑馬魚便秘模型成功建立。

陽性對照藥物能顯著促進腸道蠕動，在用BL-99處理的斑馬魚潤腸通便模型中，發(fā)現(xiàn)劑量依賴性，腸道熒光強度降低。

圖 2 BL-99對斑馬魚腸道蠕動和便秘的作用效果。腸道熒光BL-99示意圖，乳雙歧桿菌BL-99 和斑馬魚的分析區(qū)域 (A)。斑馬魚腸道中的尼羅紅熒光強度 (B) 和定量分析 (C)。

2. 成年斑馬魚的研究

2.1 炎癥與免疫基因表達

提取的RNA (A260/A280) 的純度在1.95-2.12范圍內(nèi)，如圖3A所示，經(jīng)3%的葡萄糖處理的斑馬魚顯示出IL-1β基因表達的上升。經(jīng)BL-99處理的斑馬魚模型中，觀察到IL-1β基因表達的濃度依賴性下降，BL-99組較對比組下降。

圖3.不規(guī)律高糖飲食誘導的成年斑馬魚腸道功能紊亂、腸道組織炎癥、免疫基因表達及消化酶定量。斑馬魚腸道中的IL -1β基因水平 (A)、 IL-10基因水平 (B) 和IL-12基因水平 (C)。成年斑馬魚腸道中的脂肪酶活性 (D) 含量 (E)。

如圖3B所示，經(jīng)3%的葡萄糖處理的斑馬魚顯示出IL-10基因表達的下降。相對于模型組（圖3C），BL-99在2.42*106、2.42*107和2.42*108 CFU/mL的濃度下，IL-10和IL-12的表達水平分別升高到3.96±0.219、1.27±0.150和1.85±0.176倍(p<0.001,p>0.05,p>0.05)和 1.01±0.097, 1.51±0.368和4.13±0.745倍(p>0.05,p<0.01,p<0.001)。

2.2 脂肪酶活性含量

如圖3D所示，經(jīng)3%的葡萄糖處理的斑馬魚顯示，腸脂肪酶活性降低。在用2.42*106、2.42*107和 2.42*108 CFU/mL的BL-99處理的斑馬魚模型中，可以觀察到脂肪酶活性的濃度依賴性增加。BL-99處理的脂肪酶活性與對比組相比分別為16.4±1.10、18.2±1.15和31.8±2.58 U/g蛋白（p<0.05，p<0.01，p<0.001）。

盡管BL-99 顯示出增加的趨勢，但它對腸道含量沒有統(tǒng)計學意義的影響，如圖3E所示。

2.3 腸組織病理學

如圖4A所示，H&E染色表明，正常斑馬魚的腸道具有較厚的腸壁、發(fā)達的肌肉層（a1，藍色雙頭箭頭）和腸絨毛。腸絨毛高度高、面積大、交錯分枝或指狀。正常腸杯狀細胞（b，黑色單向箭頭）數(shù)量眾多，頭部大而圓，在腸絨毛上皮細胞之間排列成行；淋巴細胞（c，黃色單向箭頭）分布在細胞內(nèi)的單層柱狀上皮中（圖4B）。模型組斑馬魚腸壁變?。╝2），絨毛稀疏且高度明顯降低，腸腔擴張（d，黑色雙箭頭）；杯狀細胞數(shù)量顯著減少；淋巴細胞數(shù)量減少（圖4C）。

與模型組相比，BL-99處理導致高絨毛發(fā)育，杯狀細胞和柱狀上皮細胞增多，腸道組織形態(tài)與正常斑馬魚非常相似（圖4D）。

圖4.用BL-99處理的斑馬魚腸道中，不規(guī)則高糖飲食引起的腸道功能障礙的組織病理學

3. 代謝特征

如圖5所示，在正負離子模式下，正常對照組和模型組有明顯的分離。正常斑馬魚與斑馬魚模型組相比，腸道內(nèi)有106種正離子代謝物和218種負離子代謝物發(fā)生顯著的統(tǒng)計學變化；213種正離子代謝物和402種負離子代謝物在模型斑馬魚和用BL-99處理的模型斑馬魚之間存在著顯著的差異。

圖5.腸道代謝譜的偏小二乘判別分析 (PLS-DA)。(A) 腸道功能障礙的斑馬魚模型組和正常組 (未治療) 之間處于正離子模式和 (B) 處于負離子模式;  (C) 腸道功能障礙斑馬魚模型組和用BL-99處理的斑馬魚模型之間處于正離子模式和 (D) 處于負離子模式。

圖6A顯示了腸道功能障礙斑馬魚（模型）和正常（未處理）斑馬魚之間代謝物顯著變化的熱圖，以及是否用BL-99處理的斑馬魚的熱圖。

圖 6.顯著變化的代謝物熱圖

● 討論

在過去幾十年里，糖的消耗量急劇增加，糖的過度消耗與腸道通透性和代謝疾病密切相關(guān)。

在本研究中，給斑馬魚喂食不規(guī)則的3%葡萄糖2周，腸道炎癥因子IL-1β基因表達升高，腸道免疫因子降低，從而誘發(fā)腸道炎癥和功能障礙。IL-10和IL-12基因水平降低、腸道脂肪酶活性降低、腸道組織學受損和腸道代謝組學紊亂。在乳雙歧桿菌BL-99處理后，斑馬魚腸道炎癥得到緩解，腸道免疫反應增強，腸道黏液屏障和組織病理學得到改善。

值得一提的是，在3%葡萄糖誘導的斑馬魚腸道功能障礙模型中觀察到腸道代謝障礙，包括腸道細胞和腸道微生物群代謝。例如，發(fā)現(xiàn)了6種腸道細胞功能相關(guān)代謝物（瓜氨酸、甘油、CDP-乙醇胺、葡萄糖酸內(nèi)酯、尿苷）和5種腸道微生物群相關(guān)代謝物（牛磺酸、中康酸、脲基琥珀酸、乳清酸和 4-羥基）。這11種代謝物，加上2種有機化合物雙-γ-谷氨酰，在經(jīng)3%葡萄糖喂食過的斑馬魚腸道中均顯著增加。

令人驚訝的是，經(jīng)乳雙歧桿菌BL-99處理，這些腸道和微生物群代謝物恢復到與正常對照斑馬魚相似或接近的水平。

這些結(jié)果表明，乳雙歧桿菌BL-99或可緩解由不規(guī)律高糖引發(fā)的腸道炎癥，并改善腸道功能（圖7）。但是，未來仍需進一步開展人體試驗，以進一步確認該菌株在人體中的功效。

圖7. BL-99 調(diào)節(jié)腸道炎癥與功能的可能機制