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本項目為國家新藥創(chuàng)制科技重大專項基金項目（2017ZX 09031059）。

核心摘要

目的：觀察二十五味肺病丸是否能夠改善微血管功能障礙并探究其潛在機制。  

方法：利用花生四烯酸誘 導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型，檢測二十五味肺病丸給藥組和對照組斑馬魚心輸出量和血流速度；用辛伐他汀誘導(dǎo)建立 斑馬魚微血管缺失模型，計算斑馬魚腸下血管面積和斑馬魚體節(jié)間血管直徑；給予普納替尼誘發(fā)斑馬魚血管內(nèi)皮 損傷模型，觀察尾靜脈血栓形成情況，以評價二十五味肺病丸對微血管功能的影響。

結(jié)果：與對照組相比，二十五味 肺病丸給藥組（27.8 mg/L）心輸出量顯著性增加（0.11 vs 0.19 nL/s，P<0.05），血流速度顯著增加（398 vs 693 μm/s，P< 0.001），腸下血管面積增加（19 335 vs 25 041 像素，P<0.05），微血管再生促進作用增強；同樣，給予二十五味肺病丸 處理后（83 和 250 μg/mL），斑馬魚節(jié)間血管直徑明顯增大（8.7 vs 11.5 vs 11.8 像素，P<0.001），血栓發(fā)生率顯著下降。  

結(jié)論：二十五味肺病丸可以改善微血管功能障礙，其可能是通過改善微血管血流動力學(xué)作用，減少血管內(nèi)皮損傷，促進內(nèi)皮再生和減少血栓生成實現(xiàn)。

● 綜述

1954年第一屆國際微循環(huán)會議正式提出了“微循環(huán)"這一概念，是指微動脈和微靜脈之間的血液循環(huán)。健全的微循環(huán)功能是機體正常運轉(zhuǎn)的重要前提。微血管的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、功能和血流動力學(xué)的破壞如血栓、血管內(nèi)皮受損、心輸出量病理性減少等危險因素發(fā)生時，可導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙，造成各器官組織營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)減少，代謝廢物的積累，引起細胞損傷和器官功能異常，嚴重者可危及生命。

大量研究表明，微血管的功能異常導(dǎo)致的微循環(huán)功能障礙與肥胖、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)。二十五味肺病丸是始載于《四部醫(yī)典》的經(jīng)典名方，其主要成分為獐牙菜、紅花、檀香、牛黃、懸鉤木、沙棘膏、訶子等25味藥材，是傳統(tǒng)藏藥理論與現(xiàn)代制藥技術(shù)相結(jié)合研發(fā)出的新型藏藥，藥物性質(zhì)更加穩(wěn)定，具有口服順應(yīng)性好，生物利用度高的特點。主要用于各種肺病引起的咳嗽，胸脅痛，呼吸急促等呼吸道疾病。

有研究表明，二十五味肺病丸能夠促進巨噬細胞吞噬功能、增強腸道蠕動等作用。二十五味肺病丸中含有紅花等具有止血、養(yǎng)血、促進新組織再生的成分，并且能夠全面消除肺部毒素，修復(fù)呼吸道損傷，因此在肺部炎癥改善方面有較好的療效，考慮到心血管系統(tǒng)尤其是微循環(huán)在改善炎癥和組織新生中的關(guān)鍵作用，推測二十五味肺病丸是否參與改善微血管功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，二十五味肺病丸能夠增加血栓斑馬魚心輸出量和血流速度，改善斑馬魚辛伐他汀誘發(fā)的微血管缺失，促進微血管再生，并且能夠減少內(nèi)皮細胞的損傷，降低血栓的發(fā)生率，為二十五味肺病丸的臨床應(yīng)用提供了藥理學(xué)依據(jù)。

● 實驗方法

1. 斑馬魚血栓模型及檢測

隨機選取180尾受精后3天（3dpf）的野生型 AB 系斑馬魚置于六孔板中（30尾/孔）。正常對照組給予溶劑對照，陽性對照組給予阿司匹林（25mg/L）；給藥組給予二十五味肺病丸27.8、83.3和250μg/mL，其后除正常對照組外其余各組給予花生四烯酸干預(yù)1h 建立血栓模型，每組隨機取10尾斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)下 錄制斑馬魚血流視頻，分析統(tǒng)計斑馬魚心輸出量（O）和血流速度（V），評價心輸出量增加作用和血流 速度增加作用，以心輸出量和血流速度的統(tǒng)計學(xué)意義分別評價其對花生四烯酸誘導(dǎo)血栓模型斑馬魚血流動力學(xué)的改善作用。

其微血管血流動力學(xué)改善作用計算公式如下：

2. 微血管缺失模型及檢測

隨機選取180尾受精后24h的轉(zhuǎn)基因血管熒光斑馬魚，置于六孔板中 （30 尾/孔）。正常對照組給予溶劑對照，模型組給予辛伐他?。?5 mg/mL）處理后，陽性對照組給予黃芪甲苷（23.5 μg/mL），藥物組給予二十五味肺病丸27.8、83.3和250μg/mL，處理2天后，每組隨機取 10 條斑馬魚在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚腸下血管、拍照并保存圖片。通過圖像分析，計算斑馬魚腸下血管面積（S），以腸下血管面積的統(tǒng)計學(xué)意義評價藥物 對辛伐他汀誘發(fā)的斑馬魚微血管缺失的再生作用。

對斑馬魚微血管缺失的再生作用計算公式如下：

3. 斑馬魚血管內(nèi)皮損傷模型及檢測

隨機選取180尾5dpf轉(zhuǎn)基因血管熒光斑馬魚（30 尾/孔）。正常對照組給予溶劑對照，模型組給予普納替尼處理后，陽性對照組給予阿司匹林（45μg/mL），藥物組給 予二十五味肺病丸27.8、83.3和250μg/mL，24 h 后 每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，拍照部位統(tǒng)一選取泄殖孔上方對應(yīng)的三根血管，通過圖像分析，計算斑馬魚體節(jié)間血管直徑（D）。以體節(jié)間血管直徑的統(tǒng)計學(xué)意義評價不同藥物對普納替尼誘發(fā)的斑馬魚血管內(nèi)皮損傷的保護作用。

對斑馬魚血管內(nèi)皮損傷（直徑減?。┑谋Ｗo作用計算公式如下：

觀察記錄血栓發(fā)生尾數(shù)，計算各組斑馬魚血栓發(fā)生率（%），以血栓發(fā)生率評價不同藥物誘發(fā)的血管內(nèi)皮損傷所致血栓的保護作用。

● 實驗結(jié)果

1. 確定斑馬魚對二十五味肺病丸的大耐受濃度

斑馬魚血栓建模成功后，給予不同濃度的二十五味肺病丸，觀察斑馬魚的死亡情況。二十五味肺病丸濃度為125和250μg/mL時，斑馬魚未產(chǎn)生任何明顯的不良反應(yīng)，也未引起斑馬魚死亡，在500和1000μg/mL濃度下均誘發(fā)100%（30/30）斑馬魚心率和血流減慢，在1500、2000 μg/mL濃度下分別誘發(fā) 26.7%（8/30）和100%（30/30）斑馬魚死亡（見表1）。因此確定血栓模型斑馬魚對二十五味肺病丸的大耐受濃度為 250μg/mL。

表1 二十五味肺病丸處理后濃度-致死性

2、二十五味肺病丸改善斑馬魚微循環(huán)血流動力學(xué)

與正常對照組（0.36 nL/s）相比，模型對照組斑馬魚心輸出量（0.11 nL/s）顯著下降，提示模型建立成功。與模型對照組相比，陽性對照藥阿司匹林25μg/mL濃度組、二十五味肺病丸27.8μg/mL濃度組斑馬魚心輸出量明顯增加（0.11vs 0.30nL/s，P<0.001；0.11vs0.19 nL/s，P<0.05），心輸出量增加作用為76%和32%。

通過進一步檢測二十五味肺病丸對血栓斑馬魚模型的血流速度的作用，與模型對照組相比，陽性對照藥阿司匹林25μg/mL濃度組、二十五味肺病丸27.8和83.3μg/mL濃度組斑馬魚心輸出量明顯增加（398vs978 μm/s，P<0.001；398vs693μm/s，P<0.001；398vs594μm/s，P<0.05），血流速度增加百分比分別為74%、37%和25%，以上結(jié)果提示二十五味肺病丸能夠增加血栓斑馬魚心輸出量，加快血流速度，改善微循環(huán)血流動力學(xué)，見表2。

3、二十五味肺病丸促進微血管再生

確定該模型中二十五味肺病丸的大耐受濃度后，進一步檢測了二十五味肺病丸對微血管再生的影響。與正常組比較，微血管缺失模型組腸下血管面積明顯減少（P<0.001）。

與模型對照組相比，二十五味肺病丸濃度為0.11μg/mL、0.33μg/mL和1μg/mL組斑馬魚腸下血管面積顯著升高（P<0.001），對微血管再生的促進作用分別為75%、78%和91%（P<0.001，見圖1、表3）。以上結(jié)果提示二十五味肺病丸能夠改善微血管損傷，促進微血管的再生。

4、二十五味肺病丸改善血管內(nèi)皮損傷

確定大耐受濃度和建模成功后，進一步檢測各組斑馬魚節(jié)間血管直徑和血栓形成情況。與模型組相比，二十五味肺病丸0.11、0.33和 1μg/mL組節(jié)間血管直徑分別為10.2、11.5和11.8像素，對血管內(nèi)皮的保護作用分別為29%、56%和61%（P>0.05、P<0.001、P<0.001，見表 4）；

同樣，與模型組血栓發(fā)生率（87%）相比，濃度為28、83和250 μg/mL的二十五味肺病丸斑馬魚血栓發(fā)生率分別為73%、50%和33%，與模型對照組比較，各組P>0.05、P<0.01、P<0.001（見表5）。

以上結(jié)果提示二十五味肺病丸能夠?qū)Π唏R魚血管內(nèi)皮損傷具有保護作用。

● 討論

正常的微循環(huán)功能是保證體內(nèi)重要臟器維持正常功能的重要前提，微血管的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，以及血流動力學(xué)的完整性是保障微循環(huán)功能正常的重要 條件。在血管內(nèi)皮細胞受損、心輸出量病理性減少、 血栓發(fā)生等危險因素發(fā)生時，微循環(huán)嚴重受損，直接危害機體健康。

大量研究表明微血管功能障 礙誘發(fā)微循環(huán)功能失調(diào)，是高血壓、肥胖和糖尿病 及許多神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管等疾病的重要發(fā)病因素。目前關(guān)于改善微循環(huán)的藥物多樣，治療效果參差不齊，不良反應(yīng)明顯，總體而言效果不盡人意， 尋找新的靶向微循環(huán)功能改善的藥物迫在眉睫。 

二十五味肺病丸是始載于《四部醫(yī)典》的經(jīng)典明方，其主要成分為獐牙菜、紅花、檀香、牛黃、懸鉤木、沙棘膏、訶子等25味藥材，其中紅花、牛黃等主要成分已經(jīng)被證明能夠增強心肌興奮性、促進血液循環(huán)等改善心血管功能的效用，并且二十五味肺病丸對肺部炎癥有較好的療效，局部微循環(huán)的功能和炎癥改善息息相關(guān)，因此二十五味肺病丸能否改善微循環(huán)功能障礙值得探究。

本研究選用了斑馬魚作為模式動物模型，探討了二十五味肺病丸在斑馬魚花生四烯酸誘導(dǎo)的血栓模型、普納替尼以及辛伐他汀誘導(dǎo)的微血管損傷模型和血管內(nèi)皮損傷模型中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二十五味肺病丸能夠改善微循環(huán)血流動力學(xué)，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)二十五味肺病 丸能夠增加斑馬魚 25%的血流速度，大增加32%血栓斑馬魚的心輸出量，這表明二十五味肺病丸能夠通過調(diào)節(jié)心肌收縮能力，促進心臟泵血，從而增加微血管血壓，保障微循環(huán)充盈壓，有助于改善病 變局部的物質(zhì)交換。

炎癥發(fā)生時，組織局部的脈管 系統(tǒng)常常受損，因此微循環(huán)血管損傷的改善和血管 新生在改善炎癥中起到重要作用，二十五味肺病丸組斑馬魚節(jié)間血管直徑明顯增大，表明二十五味肺病丸能夠有效地保護斑馬魚節(jié)間血管，減少血管內(nèi)皮損傷，并且二十五味肺病丸斑馬魚腸下血管面積顯著增加，提示二十五味肺病丸促進了斑馬魚血管的新生。

因此，二十五味肺病丸能夠改善微循環(huán)血流動力學(xué)，促進組織局部的物質(zhì)交換，并且減少微血管內(nèi)皮損傷，促進微血管新生，極大限度地保障了微血管功能的行使，進而減少血栓生成，起到改 善微循環(huán)并促進其恢復(fù)功能的作用。 

綜上所述，二十五味肺病丸可以顯著減少血管內(nèi)皮損傷，促進其再生，改善微血管血流動力學(xué)作用，減少血栓生成，改善微血管功能障礙。二十五味肺病丸改善微血管功能的研究發(fā)現(xiàn)為其在臨床上 微循環(huán)功能障礙性疾病中的應(yīng)用提供了藥理基礎(chǔ)， 也為臨床治療微循環(huán)功能障礙提供了潛在的治療藥物。但考慮斑馬魚非哺乳動物，其具體藥效和詳細的分子機制有待在哺乳動物中進行進一步驗證。

作者：強巴，郭勝亞，陳倫舉，徐懿喬，李峰

本文發(fā)表于：《天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報》2021年12月第40卷第6期

作者單位：西藏奇正藏藥股份有限公司，杭州環(huán)特生物科技股份有限公司