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核心摘要

目的：探討益身清對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用。

方法：隨機(jī)選取受精后5 d（5 dpf）野生型AB品系斑 馬魚于培養(yǎng)皿中，用尼羅紅喂飼斑馬魚建立腸蠕動(dòng)模型，分組后藥效學(xué)組分別給予不同濃度的益身清和多潘立酮，24 h后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，以熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)益身清對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用。

結(jié)果：益身清不同劑量組（125、250、500、1000、2000 μg/mL）斑馬魚的腸蠕動(dòng)促進(jìn)作用分別為25%、45%、49%、62%和66%，與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），提示 在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下益身清對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)有明顯的促進(jìn)作用。

結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下，益身清對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)有明顯的促進(jìn)作用。

● 綜述

腸道是人體很大的免疫器官和排毒器官，腸道蠕動(dòng)能力的強(qiáng)弱在一定程度上影響著腸道的生理功能，與人體的健康息息相關(guān)，便秘就是其中一種常見的復(fù)雜的臨床癥狀，表現(xiàn)為排便次數(shù)少，糞便干硬和（或）排便困難。流行病學(xué)研究顯示，由于生活條件、飲食結(jié)構(gòu)、生活壓力及心理社會(huì)等因素影響，便秘的發(fā)生率持續(xù)升高，但長期使用瀉劑來改善便秘，會(huì)導(dǎo)致不同程度的副作用，如結(jié)腸黑變病，增加患結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)等。

因此，尋找天然、有效、不傷腸道的產(chǎn)品治療便秘顯得尤為重要。針對(duì)這種現(xiàn)狀，東方藥林藥業(yè)有限公司創(chuàng)制了中藥健康產(chǎn)品益身清固體飲料，希望通過促進(jìn)腸道蠕動(dòng)起到通便的作用， 進(jìn)而達(dá)到緩解便秘的效果，而自產(chǎn)品上市銷售以來，收到大量使用反饋，提示通便作用明顯。但其藥理作用和機(jī)制尚不明確。

因此，本實(shí)驗(yàn)選擇具有經(jīng)濟(jì)高效、預(yù)測(cè)性好、可比度高 等優(yōu)點(diǎn)的斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，探討了益身清對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)障礙的作用，為了易于觀察和統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)以尼羅紅喂飼斑馬魚建立腸蠕動(dòng)模型，以熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)作為觀察指標(biāo)，研究益身清對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用，進(jìn)而證明益身清的通便作用，并為斑馬魚腸道運(yùn)動(dòng)障礙評(píng)價(jià)乃至食品成分生物活性的研究奠定理論基礎(chǔ)，為產(chǎn)品在緩解便秘方面的應(yīng)用提供安全、有效的依據(jù)。

● 實(shí)驗(yàn)方法

1. 造模

利用斑馬魚卵暴露于尼羅紅溶液中，富含脂肪的組織卵黃囊與之結(jié)合，當(dāng)斑馬魚發(fā)育到5～6d時(shí)，大部分尼羅紅被卵黃囊吸收，在熒光顯微鏡下可以清晰觀察到腸道中尼羅紅的充盈情況，說明斑馬魚腸蠕動(dòng)模型建立。

2. 實(shí)驗(yàn)給藥

2.1 耐受濃度（MTC）劑量實(shí)驗(yàn)組

隨機(jī)選取180尾受精后6d（6spf）模型斑馬魚于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚，養(yǎng)殖用水養(yǎng)殖，分別給予益身清250、500、1000、1500和2000μg/mL濃度的水溶液，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組（養(yǎng)魚 用水處理斑馬魚），每孔（實(shí)驗(yàn)組）加入3mL。益身清處理24 h后，觀察記錄斑馬魚的表型和死亡情況，確定益身清對(duì)斑馬魚的MTC。

2.2 益身清對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)促進(jìn)作用藥效組

正常對(duì)照組：養(yǎng)魚用水處理模型斑馬魚；

陽性對(duì)照組：多潘立酮30μg/mL；

實(shí)驗(yàn)1組：益身清125 μg/mL；

實(shí)驗(yàn)2組：益身清250 μg/mL；

實(shí)驗(yàn)3組：益身清500 μg/mL；

實(shí)驗(yàn)4組：益身清1000 μg/mL；

實(shí)驗(yàn)5 組：益身清2000 μg/mL。

2.3 觀察指標(biāo)

記錄耐受濃度（MTC）劑量實(shí)驗(yàn)組各組斑馬魚的表型和死亡情況，用以分析本實(shí)驗(yàn)不同劑量對(duì)斑馬魚的安全性；藥效各組分別給予相應(yīng)的藥物，24h后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集斑馬魚腸道內(nèi)容物（尼羅紅）熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，用以觀察斑馬魚腸蠕動(dòng)情況。

用NIS-Elements D3.10高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算斑馬魚腸道內(nèi)容物（尼羅紅）熒光強(qiáng)度（S），并進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，以熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)益身清對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用。益身清對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用計(jì)算公式如下：

● 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 耐受濃度（MTC）測(cè)定

益身清在250～2000μg/mL濃度下，對(duì)斑馬魚未產(chǎn)生任何明顯的毒副作用，也未引起死亡，故確定益身清對(duì)斑馬魚的MTC為2000 μg/mL（此濃度為耐受濃度檢測(cè)上限）。（見表1）

2、益身清對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)促進(jìn)作用評(píng)價(jià)

陽性對(duì)照藥多潘立酮30μg/mL濃度組斑馬魚腸道內(nèi)容物（尼羅紅）熒光 強(qiáng)度總和低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），其 對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)促進(jìn)作用為43%，說明多潘立酮對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)有明顯的促進(jìn)作用。益身清125、250、500、1000和2000μg/mL濃度組斑馬魚腸道內(nèi)容物（尼羅紅）熒光強(qiáng)度總和低于正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），提示益身清在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)有明顯的促進(jìn)作用。（見表2、圖1~2）

● 討論

斑馬魚模型用于新藥篩選，始于20世紀(jì)90年代，如今已成為繼大鼠和小鼠之后的第三大模式生物，被廣泛應(yīng)用于藥物篩選和藥物安全性評(píng)價(jià)當(dāng)中。

國際斑馬魚模式生物數(shù)據(jù)庫（ZFIN）中注冊(cè)的斑馬魚實(shí)驗(yàn)室多達(dá)1304個(gè)，我國僅斑馬魚生產(chǎn)和使用單位就有300多家，在與胃腸道方面相關(guān)的斑馬魚實(shí)驗(yàn)有如益生菌對(duì)嗜水氣單胞菌感染斑馬魚模型腸道黏膜免疫的保護(hù)作用研究、根據(jù)斑馬魚模型的熒光強(qiáng)度和腸道蠕動(dòng)促進(jìn)作用對(duì)菌株其進(jìn)行篩選、基于斑馬魚模型的低聚果糖和低聚異麥芽糖對(duì)腸道蠕動(dòng)促進(jìn)作用的研究等。

在目前采用斑馬魚進(jìn)行功效及機(jī)制評(píng)價(jià)的研究多集中于食物提取物或者益生菌，對(duì)食品全組分功效學(xué)研究篩選的報(bào)道較少的情況下，本研究利用臨床常用的具有促進(jìn)腸蠕動(dòng)作用的多潘立酮作為新型模式生物斑馬魚實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照藥物進(jìn)行食品全組分的功效學(xué)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)想結(jié)果、傳統(tǒng)動(dòng)物模型的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，亦為陽性；但耗費(fèi)的時(shí)間更短、成本更少、操作更簡便、結(jié)果更易于觀察。

這就為斑馬魚模型在食品全組分的腸道蠕動(dòng)藥效學(xué)方面的篩選應(yīng)用和功效評(píng)估提供了有利參考，為胃腸道運(yùn)動(dòng)障礙藥物的動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)、功能食品的開發(fā)提供了平價(jià)、快速、行之有效的 方法和有用工具。

本實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品由低聚果糖、菊粉、阿拉伯膠、白茅根、菊花、柳橙水果粉、草莓藍(lán)莓混合果粉、梨果仙人掌果汁粉等天然植物食品原料組成；配方以益生元低聚果糖、菊粉代替?zhèn)鹘y(tǒng)食糖，不參與機(jī)體糖代謝、*；菊花和白茅根是我國傳統(tǒng)藥食同源中藥材，在方中起到清熱、抗炎的作用；低聚果糖、菊粉、梨果仙人掌果汁粉均為新食品原料，阿拉伯膠 是常用的多糖類食品添加劑，柳橙水果粉、草莓藍(lán)莓混合果 粉是常見水果的果汁粉末。在本實(shí)驗(yàn)條件下，益身清組斑馬魚的腸道蠕動(dòng)促進(jìn)作用與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＜0.001），提示在本實(shí)驗(yàn)濃度條件下益身清對(duì)斑馬魚腸蠕動(dòng)有明顯的促進(jìn)作用，達(dá)到了預(yù)期的通便效果。

綜上所述，益身清產(chǎn)品能通過促進(jìn)斑馬魚腸蠕動(dòng)從而達(dá)到通便的功能，其機(jī)制可能與益身清能促進(jìn)斑馬魚腸道蠕動(dòng)能力有關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)也存在一定的不足和局限性，如益身清產(chǎn)品在便秘方面的具體作用機(jī)制還需要通過建立斑馬魚便秘模型進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，而在以斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的 過程中，還不能明確的觀察到產(chǎn)品對(duì)斑馬魚是否有產(chǎn)生胃腸道脹氣、腸鳴等不良反應(yīng)，因此這可能還需要結(jié)合哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體試驗(yàn)提供更可靠、有效的研究體系。

作者：錢星文，譚轉(zhuǎn)換，朱 晨，肖市林，莫志賢，伍小

作者單位：東方藥林藥業(yè)有限公司，南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院

本文發(fā)表于：《中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》2020 年11月第26卷第15期

特別說明：本項(xiàng)目為環(huán)特生物客戶基于斑馬魚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ退鞯难芯宽?xiàng)目，也是國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81673628，81873030）、廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201707010287）