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核心摘要

目的：探討益身清對斑馬魚腸蠕動的促進(jìn)作用。

方法：隨機選取受精后5 d（5 dpf）野生型AB品系斑 馬魚于培養(yǎng)皿中，用尼羅紅喂飼斑馬魚建立腸蠕動模型，分組后藥效學(xué)組分別給予不同濃度的益身清和多潘立酮，24 h后每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，以熒光強度的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果評價益身清對斑馬魚腸蠕動的促進(jìn)作用。

結(jié)果：益身清不同劑量組（125、250、500、1000、2000 μg/mL）斑馬魚的腸蠕動促進(jìn)作用分別為25%、45%、49%、62%和66%，與正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），提示 在本實驗濃度條件下益身清對斑馬魚腸蠕動有明顯的促進(jìn)作用。

結(jié)論：在本實驗濃度條件下，益身清對斑馬魚腸蠕動有明顯的促進(jìn)作用。

● 綜述

腸道是人體很大的免疫器官和排毒器官，腸道蠕動能力的強弱在一定程度上影響著腸道的生理功能，與人體的健康息息相關(guān)，便秘就是其中一種常見的復(fù)雜的臨床癥狀，表現(xiàn)為排便次數(shù)少，糞便干硬和（或）排便困難。流行病學(xué)研究顯示，由于生活條件、飲食結(jié)構(gòu)、生活壓力及心理社會等因素影響，便秘的發(fā)生率持續(xù)升高，但長期使用瀉劑來改善便秘，會導(dǎo)致不同程度的副作用，如結(jié)腸黑變病，增加患結(jié)直腸癌風(fēng)險等。

因此，尋找天然、有效、不傷腸道的產(chǎn)品治療便秘顯得尤為重要。針對這種現(xiàn)狀，東方藥林藥業(yè)有限公司創(chuàng)制了中藥健康產(chǎn)品益身清固體飲料，希望通過促進(jìn)腸道蠕動起到通便的作用， 進(jìn)而達(dá)到緩解便秘的效果，而自產(chǎn)品上市銷售以來，收到大量使用反饋，提示通便作用明顯。但其藥理作用和機制尚不明確。

因此，本實驗選擇具有經(jīng)濟高效、預(yù)測性好、可比度高 等優(yōu)點的斑馬魚作為實驗動物模型，探討了益身清對胃腸道運動障礙的作用，為了易于觀察和統(tǒng)計，實驗以尼羅紅喂飼斑馬魚建立腸蠕動模型，以熒光強度數(shù)據(jù)作為觀察指標(biāo)，研究益身清對斑馬魚腸蠕動的促進(jìn)作用，進(jìn)而證明益身清的通便作用，并為斑馬魚腸道運動障礙評價乃至食品成分生物活性的研究奠定理論基礎(chǔ)，為產(chǎn)品在緩解便秘方面的應(yīng)用提供安全、有效的依據(jù)。

● 實驗方法

1. 造模

利用斑馬魚卵暴露于尼羅紅溶液中，富含脂肪的組織卵黃囊與之結(jié)合，當(dāng)斑馬魚發(fā)育到5～6d時，大部分尼羅紅被卵黃囊吸收，在熒光顯微鏡下可以清晰觀察到腸道中尼羅紅的充盈情況，說明斑馬魚腸蠕動模型建立。

2. 實驗給藥

2.1 耐受濃度（MTC）劑量實驗組

隨機選取180尾受精后6d（6spf）模型斑馬魚于六孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚，養(yǎng)殖用水養(yǎng)殖，分別給予益身清250、500、1000、1500和2000μg/mL濃度的水溶液，同時設(shè)置正常對照組（養(yǎng)魚 用水處理斑馬魚），每孔（實驗組）加入3mL。益身清處理24 h后，觀察記錄斑馬魚的表型和死亡情況，確定益身清對斑馬魚的MTC。

2.2 益身清對斑馬魚腸蠕動促進(jìn)作用藥效組

正常對照組：養(yǎng)魚用水處理模型斑馬魚；

陽性對照組：多潘立酮30μg/mL；

實驗1組：益身清125 μg/mL；

實驗2組：益身清250 μg/mL；

實驗3組：益身清500 μg/mL；

實驗4組：益身清1000 μg/mL；

實驗5 組：益身清2000 μg/mL。

2.3 觀察指標(biāo)

記錄耐受濃度（MTC）劑量實驗組各組斑馬魚的表型和死亡情況，用以分析本實驗不同劑量對斑馬魚的安全性；藥效各組分別給予相應(yīng)的藥物，24h后每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集斑馬魚腸道內(nèi)容物（尼羅紅）熒光強度數(shù)據(jù)，用以觀察斑馬魚腸蠕動情況。

用NIS-Elements D3.10高級圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計算斑馬魚腸道內(nèi)容物（尼羅紅）熒光強度（S），并進(jìn)行分析統(tǒng)計，以熒光強度的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果評價益身清對斑馬魚腸蠕動的促進(jìn)作用。益身清對斑馬魚腸蠕動的促進(jìn)作用計算公式如下：

● 實驗結(jié)果

1. 耐受濃度（MTC）測定

益身清在250～2000μg/mL濃度下，對斑馬魚未產(chǎn)生任何明顯的毒副作用，也未引起死亡，故確定益身清對斑馬魚的MTC為2000 μg/mL（此濃度為耐受濃度檢測上限）。（見表1）

2、益身清對斑馬魚腸蠕動促進(jìn)作用評價

陽性對照藥多潘立酮30μg/mL濃度組斑馬魚腸道內(nèi)容物（尼羅紅）熒光 強度總和低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），其 對斑馬魚腸蠕動促進(jìn)作用為43%，說明多潘立酮對斑馬魚腸蠕動有明顯的促進(jìn)作用。益身清125、250、500、1000和2000μg/mL濃度組斑馬魚腸道內(nèi)容物（尼羅紅）熒光強度總和低于正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），提示益身清在本實驗濃度條件下對斑馬魚腸蠕動有明顯的促進(jìn)作用。（見表2、圖1~2）

● 討論

斑馬魚模型用于新藥篩選，始于20世紀(jì)90年代，如今已成為繼大鼠和小鼠之后的第三大模式生物，被廣泛應(yīng)用于藥物篩選和藥物安全性評價當(dāng)中。

國際斑馬魚模式生物數(shù)據(jù)庫（ZFIN）中注冊的斑馬魚實驗室多達(dá)1304個，我國僅斑馬魚生產(chǎn)和使用單位就有300多家，在與胃腸道方面相關(guān)的斑馬魚實驗有如益生菌對嗜水氣單胞菌感染斑馬魚模型腸道黏膜免疫的保護作用研究、根據(jù)斑馬魚模型的熒光強度和腸道蠕動促進(jìn)作用對菌株其進(jìn)行篩選、基于斑馬魚模型的低聚果糖和低聚異麥芽糖對腸道蠕動促進(jìn)作用的研究等。

在目前采用斑馬魚進(jìn)行功效及機制評價的研究多集中于食物提取物或者益生菌，對食品全組分功效學(xué)研究篩選的報道較少的情況下，本研究利用臨床常用的具有促進(jìn)腸蠕動作用的多潘立酮作為新型模式生物斑馬魚實驗的陽性對照藥物進(jìn)行食品全組分的功效學(xué)研究，實驗結(jié)果與預(yù)想結(jié)果、傳統(tǒng)動物模型的相關(guān)實驗結(jié)果一致，亦為陽性；但耗費的時間更短、成本更少、操作更簡便、結(jié)果更易于觀察。

這就為斑馬魚模型在食品全組分的腸道蠕動藥效學(xué)方面的篩選應(yīng)用和功效評估提供了有利參考，為胃腸道運動障礙藥物的動力學(xué)評價試驗、功能食品的開發(fā)提供了平價、快速、行之有效的 方法和有用工具。

本實驗產(chǎn)品由低聚果糖、菊粉、阿拉伯膠、白茅根、菊花、柳橙水果粉、草莓藍(lán)莓混合果粉、梨果仙人掌果汁粉等天然植物食品原料組成；配方以益生元低聚果糖、菊粉代替?zhèn)鹘y(tǒng)食糖，不參與機體糖代謝、*；菊花和白茅根是我國傳統(tǒng)藥食同源中藥材，在方中起到清熱、抗炎的作用；低聚果糖、菊粉、梨果仙人掌果汁粉均為新食品原料，阿拉伯膠 是常用的多糖類食品添加劑，柳橙水果粉、草莓藍(lán)莓混合果 粉是常見水果的果汁粉末。在本實驗條件下，益身清組斑馬魚的腸道蠕動促進(jìn)作用與正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意 義（P＜0.001），提示在本實驗濃度條件下益身清對斑馬魚腸蠕動有明顯的促進(jìn)作用，達(dá)到了預(yù)期的通便效果。

綜上所述，益身清產(chǎn)品能通過促進(jìn)斑馬魚腸蠕動從而達(dá)到通便的功能，其機制可能與益身清能促進(jìn)斑馬魚腸道蠕動能力有關(guān)。而本實驗也存在一定的不足和局限性，如益身清產(chǎn)品在便秘方面的具體作用機制還需要通過建立斑馬魚便秘模型進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，而在以斑馬魚作為實驗動物的 過程中，還不能明確的觀察到產(chǎn)品對斑馬魚是否有產(chǎn)生胃腸道脹氣、腸鳴等不良反應(yīng)，因此這可能還需要結(jié)合哺乳動物實驗及人體試驗提供更可靠、有效的研究體系。

作者：錢星文，譚轉(zhuǎn)換，朱 晨，肖市林，莫志賢，伍小

作者單位：東方藥林藥業(yè)有限公司，南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院

本文發(fā)表于：《中醫(yī)藥導(dǎo)報》2020 年11月第26卷第15期

特別說明：本項目為環(huán)特生物客戶基于斑馬魚實驗?zāi)Ｐ退鞯难芯宽椖?，也是國家自然科學(xué)基金項目（81673628，81873030）、廣州市科技計劃項目（201707010287）