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精原干細胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）是成體雄性性腺中具有自我更新和分化潛能的一類生殖干細胞。利用精原干細胞移植（Spermatogonial stem cell transplantation, SSCT）技術，有可能實現(xiàn)跨個體甚至是跨物種的“借腹生殖"，也就是利用個體（或物種）B產(chǎn)生個體（或物種）A的功能性配子。SSCT“借腹生殖"是研究配子發(fā)生和性腺發(fā)育的一項重要技術，同時其在快速、高效的定向育種中也具有廣闊的應用前景。SSCT“借腹生殖"能否在遺傳距離較大（如跨亞科及以上遺傳距離）的不同物種間實現(xiàn)，是這一領域的經(jīng)典難題。

近日，錢江特聘專家、中國科學院水生生物研究所孫永華課題組在Science China Life Sciences發(fā)表了題為"Surrogate production of genome edited sperm from adifferent subfamily by spermatogonial stem cell transplantation“的研究論文，利用魚類SSCT實現(xiàn)了亞科物種間的“借腹生殖"，并成功獲得了跨亞科物種來源的經(jīng)基因編輯的SSCTjingzi。該項研究受到國家杰出青年科學基金、“發(fā)育編程及其代謝調(diào)節(jié)"國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金創(chuàng)新研究群體等科研項目的支持。

研究成果概述

在前期的研究中，孫永華課題組在斑馬魚中建立并優(yōu)化了魚類基因編輯配子的“借腹生殖"技術（J Genet Genomics，2020；Faculty of 1000推薦），快速而高效地獲得了純合突變致死基因的母源合子突變體，從而為斑馬魚母源基因的功能研究開辟了一條新的途徑。

為進一步探究在魚類異種間能否建立基因編輯配子的“借腹生殖"技術，該團隊選擇了跨亞科的兩個魚類物種——稀有鮈鯽和斑馬魚——作為SSCT供體和受體，將生殖細胞靶向的CRISPR/Cas9基因編輯和SSCT“借腹生殖"技術進行有機整合和優(yōu)化，成功利用受體斑馬魚快速、高效地獲得了供體稀有鮈鯽來源的經(jīng)基因編輯的jingzi（圖1）。

圖1. 該研究技術路線圖及稀有鮈鯽SSCs的分離及向斑馬魚幼魚的移植

為追溯供體稀有鮈鯽SSCs在受體斑馬魚中的發(fā)育命運，研究者精細刻畫了移植SSCs在斑馬魚性腺中定植、增殖、分化的全過程，并通過組學和實驗生物學手段證實了SSCT精巢是由供體稀有鮈鯽生殖細胞和受體斑馬魚性腺體細胞所構成的嵌合性腺（圖2）。有趣的是，“借腹生殖"斑馬魚所產(chǎn)生的SSCTjingzi，雖然其核基因組*來源于供體稀有鮈鯽且只能與稀有鮈鯽卵進行受精，但其形態(tài)學特征和游動行為更接近于受體斑馬魚jingzi。

通過比較SSCTjingzi和普通稀有鮈鯽jingzi的轉錄組，研究者發(fā)現(xiàn)斑馬魚性腺體細胞的一些轉錄產(chǎn)物可能通過某種方式被轉運到了SSCTjingzi細胞中，從而影響了“借腹生殖"所產(chǎn)生的稀有鮈鯽jingzi的形態(tài)和行為特征。該研究也是利用“借腹生殖"技術產(chǎn)生異種來源的基因編輯配子，這為利用該技術定制未來養(yǎng)殖魚類的配子奠定了堅實的理論和實驗基礎。

圖2 SSCT精巢是由稀有鮈鯽（Gr）的生殖細胞和斑馬魚（Dr）的體細胞構成

附論文詳細版

一、綜述

精原干細胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）是成體雄性性腺中具有自我更新和分化潛能的一類生殖干細胞。利用精原干細胞移植（Spermatogonial stem cell transplantation, SSCT）技術，有可能實現(xiàn)跨個體甚至是跨物種的“借腹生殖"，也就是利用個體（或物種）B產(chǎn)生個體（或物種）A的功能性配子。

在魚類中，這項技術首先應用在斑馬魚——一種廣泛使用的模式動物上，然后擴展到其他魚類，如鮭魚和虹鱒魚 。在之前的實驗中，不同類型的 GSC，例如 PGC、SSC 和卵源干細胞 (OSC)，已被用作移植到其他物種的胚胎、幼蟲或成蟲中的供體。作為容易獲得的 GSC 類型，SSC 已被廣泛地用于移植。SSCT“借腹生殖"是研究配子發(fā)生和性腺發(fā)育的一項重要技術，同時其在快速、高效的定向育種中也具有廣闊的應用前景。

生殖細胞靶向的CRISPR/Cas9基因編輯技術已被用于多種魚類，以研究基因功能或潛在地改善水產(chǎn)養(yǎng)殖育種，并且已經(jīng)產(chǎn)生了大量基因無效突變體，如斑馬魚。此外，如果我們打算生產(chǎn)體型較大的基因組編輯魚，通常需要龐大且昂貴的設施來飼養(yǎng)和篩選個體。

近來，我們開發(fā)了一種方法，在斑馬魚中建立并優(yōu)化了魚類基因編輯配子的“借腹生殖"技術（J Genet Genomics，2020；Faculty of 1000推薦），通過結合 PGCs 靶向基因組編輯和 PGCs 移植 (PGCT) 技術，快速而高效地獲得了純合突變致死基因的母源合子突變體。然而，SSCT“借腹生殖"能否在遺傳距離較大（如跨亞科及以上遺傳距離）的不同物種間實現(xiàn)，是這一領域的經(jīng)典難題。

稀有鮈鯽，隸屬于鯉形目、鯉科、鮈鯽屬，主要分布于長江上游大渡河支流和中國四川省的一些小河中。近年來，稀有鮈鯽由于棲息地破壞、外來魚類的引入和過度捕撈，在野生環(huán)境中越來越少見，已被列為瀕危物種。 

近年來，稀有鮈鯽因其體型小、易于養(yǎng)殖、繁殖力強、胚胎透明、對魚鱗病敏感等優(yōu)良特性，已發(fā)展成為研究魚類病理學、遺傳學、環(huán)境科學、胚胎學和生理生態(tài)學的實驗用魚。通過結合 CRISPR/Cas9 和異種 SSCT 技術，這兩種來自不同亞科的實驗室魚類，是探索替代生產(chǎn)進化遙遠物種衍生的基因組編輯配子的可行性的理想選擇。

在這里，為進一步探究在魚類異種間能否建立基因編輯配子的“借腹生殖"技術，我們使用跨亞科的兩個魚類物種——稀有鮈鯽和斑馬魚——作為SSCT供體和受體，將生殖細胞靶向的CRISPR/Cas9基因編輯和SSCT“借腹生殖"技術進行有機整合和優(yōu)化，成功利用受體斑馬魚快速、高效地獲得了供體稀有鮈鯽來源的經(jīng)基因編輯的jingzi， 明確了斑馬魚性腺中定殖、增殖和分化的動態(tài)過程。 有趣的是，“借腹生殖"斑馬魚所產(chǎn)生的SSCTjingzi，雖然其核基因組*來源于供體稀有鮈鯽且只能與稀有鮈鯽卵進行受精，但其形態(tài)學特征和游動行為更接近于受體斑馬魚jingzi。

二、實驗結果

1、供體稀有鮈鯽SSCs在受體斑馬魚中的定植、增殖、分化

為了更好地了解移植SSCs 在斑馬魚受體中的發(fā)育動態(tài)，我們分析了斑馬魚受體的定植、增殖和分化。 通過組學和實驗生物學手段證實了SSCT精巢是由供體稀有鮈鯽生殖細胞和受體斑馬魚性腺體細胞所構成的嵌合性腺。

首先，在 3 wpt 時，通過使用供體細胞的紅色熒光標記，我們觀察到熒光供體細胞在游泳膀胱下方的受體性腺區(qū)域定植（圖 4A, a），而在未經(jīng)處理的對照幼蟲中未觀察到熒光（圖 4一、二）。進一步的解剖和觀察表明，許多熒光供體細胞定植在宿主斑馬魚的性腺中（圖 4A, a'），而在未移植的對照性腺中未觀察到熒光（圖 4A, b')。根據(jù)不同的供體和受者，定植率從 25% 到 85% 不等。

圖4 定植、增殖和分化稀有鮈鯽 斑馬魚受體中的 SSC

為了研究供體 SSC 的增殖，我們進行了 EdU 檢測，發(fā)現(xiàn) SSC 定植的斑馬魚性腺中存在大量增殖性 VASA 陽性生殖細胞（圖 4B, b）, 只是模仿 WT 斑馬魚性腺中的那些 (圖 4B, a)，而未移植的對照性腺中沒有增殖生殖細胞（圖 4乙，丙）。

為了進一步表征 SSCT 移植魚生殖細胞的增殖和分化，我們用有絲分裂標記 PH3 對精巢進行了免疫熒光染色。在發(fā)育的精巢中，SSCT陽性的精巢中有很多細胞在進行有絲分裂和減數(shù)分裂（圖 4C, d–d')，模仿在稀有鮈鯽精巢（圖 4C, a, b, a', b') 和斑馬魚成年精巢 (圖 4C, c-c')。VASA 的免疫染色證實移植的稀有鮈鯽SSCs恢復了不育斑馬魚雄性的jingzi發(fā)生，在SSCT陽性精巢中觀察到了包括精原細胞、精母細胞、jingzi細胞和jingzi在內(nèi)的各種生殖細胞（圖 4C, d''）, 與 WT 中看到的一致稀有鮈鯽(圖 4C, b'') 和斑馬魚精巢(圖 4C, c'')。相比之下，在 3 mpf 時，稀有鮈鯽精巢僅含有大量精原細胞和精母細胞，只有少數(shù)jingzi細胞（圖 4C, a, a', a'') 和大量的精母細胞在前細線期或細線期，表明減數(shù)分裂的開始（圖 4C, a')。這些表明，稀有鮈鯽的生殖細胞可以有效地增殖和分化 斑馬魚宿主精巢，SSCT 精巢的成熟期與斑馬魚精巢相似。

2、替代精巢中不同性腺細胞的組成

為了進一步表征替代精巢中不同性腺細胞的組成，我們進行了 RNA針對生殖細胞物種特異性標記的雜交分析，以及兩種類型的性腺體細胞。

有趣的是，在 SSCT 精巢中，只有稀有鮈鯽可以檢測到生殖細胞，但不能檢測到斑馬魚生殖細胞（圖 5A, c-c'); 而 Leydig 細胞和 Sertoli 細胞均來自宿主斑馬魚（圖 5B, c-c', C, c-c')，表明 SSCT 精巢是重建的性腺，包括稀有鮈鯽衍生的生殖細胞和斑馬魚衍生的性腺體細胞。

圖5 SSCT 陽性精巢由供體來源的生殖細胞和受體來源的性腺體細胞組成

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)稀有鮈鯽 SSCs不僅可以在斑馬魚受體體內(nèi)定殖和增殖，還可以支持斑馬魚性腺體細胞的發(fā)育和功能，在重建的功能精巢中進行正常的jingzi發(fā)生并分化為jingzi。

3、來自 SSCT 的jingzi形態(tài)和游泳行為與宿主相似，但與供體不同

盡管 SSCT 陽性斑馬魚可以產(chǎn)生功能性稀有鮈鯽 jingzi，我們感興趣的是來自替代斑馬魚的jingzi和來自替代斑馬魚的jingzi之間是否存在任何差異性。

通過掃描電子顯微鏡 (SEM) 分析，SSCT jingzi的形態(tài)看起來更類似于斑馬魚jingzi而不是稀有鮈鯽jingzi，因為前兩個具有突出的線粒體鞘結構（圖 6A），他們擁有橢圓形的球頭，而稀有鮈鯽 jingzi頭部看起來更圓，沒有典型的線粒體鞘（圖 6A、a'、b'、c'）。

圖6 來自 SSCT 陽性斑馬魚jingzi的形態(tài)和活性與宿主相似，但與供體不同

此外，SSCT jingzi的平均頭部直徑(1.55 微米) 明顯大于稀有鮈鯽 jingzi (1.46 微米), 并且更接近斑馬魚jingzi (1.65 微米) (圖 6B)。SSCTjingzi平均尾長(30.32 微米) 幾乎與斑馬魚jingzi相似 (30.80 微米), 但明顯短于稀有鮈鯽 jingzi (32.42 微米) (圖 6C）。它們鞭毛的中心是具有典型“9×2+2"微管結構的軸向細絲（圖S5A，支持信息中的a-c），尾巴直徑在它們之間沒有顯著差異。

透射電子顯微鏡 (TEM) 分析表明，頭部膜在稀有鮈鯽（圖 S5A，a'）和 SSCT jingzi（圖 S5A，c'），而斑馬魚jingzi則是平滑的（圖 S5A，b'）。斑馬魚jingzi在頭前部具有明顯的細胞質(zhì)。統(tǒng)計表明，線粒體數(shù)量在稀有鮈鯽和 SSCT jingzi，與斑馬魚jingzi相比（圖 S5C）。

隨后，游動時的稀有鮈鯽, 斑馬魚和 SSCT jingzi被測量,并且 SSCT jingzi的軌跡圖類似于斑馬魚jingzi的軌跡圖而不是稀有鮈鯽jingzi（圖 6D)。

統(tǒng)計表明，“借腹生殖"斑馬魚所產(chǎn)生的SSCTjingzi，雖然其核基因組*來源于供體稀有鮈鯽且只能與稀有鮈鯽卵進行受精，但其形態(tài)學特征和游動行為更接近于受體斑馬魚jingzi。

4、高效生產(chǎn) pou5f3 和 chd-變異的稀有鮈鯽斑馬魚替代品中的jingzi

在之前的研究中，我們通過結合 CRISPR/Cas9 基因敲除技術和同種異體 PGCT 在斑馬魚中成功生成了供體來源的基因組編輯配子。

為了進一步驗證SSCT“借腹生殖"能否在遺傳距離較大（如跨亞科及以上遺傳距離）的不同物種間實現(xiàn)，我們選擇了對大腦和背部發(fā)育至關重要的兩個基因——pou5f3和 慢性病 ，通過比較SSCTjingzi和稀有鮈鯽jingzi的轉錄組，SSCs 被純化并用于異種 SSCT 進入斑馬魚替代物。研究驗證了稀有鮈鯽通過 CRISPR/Cas9 靶向 SSCT 技術，可以在相對較短的成熟期內(nèi)在斑馬魚宿主中有效地獲得突變jingzi。

當移植的斑馬魚在 3 mpf 長到成年時，通過將它們與 WT 斑馬魚雌性一一交配來篩選出 SSCT 陽性個體。為了評估 SSCT 陽性雄性產(chǎn)生的jingzi的突變效率，分析了 SSCT 陽性雄性和斑馬魚雌性雜交的每個胚胎的靶序列。

令人驚訝的是，SSCT jingzi的突變效率在10 個pou5f3-變異的稀有鮈鯽jingzi中都達到了 100%。此外，51.8%的后代表現(xiàn)出典型的表型，軀干縮短，尾巴異常。（圖 7B, c) 表型分析表明，C1 胚胎在 30 hpf 時顯示出正常的腦結構，包括頂蓋（t）、小腦（c）、后腦（h）和耳板（o）（圖 7B, b')，而在 C2 胚胎中，后腦是雜亂無章的（圖 7B, c', 紅色箭頭），耳板縮小，僅包含一個耳石（圖 7B，c'，藍色箭頭）。α-微管蛋白染色進一步證實了 C2 胚胎在 2 dpf 時腦結構的紊亂（圖 7C）。這些結果與在斑馬魚中的結果一致。

圖7 高效生產(chǎn)基因組編輯稀有鮈鯽斑馬魚替代品中的jingzi

5、SSCT jingzi與 稀有鮈鯽轉錄組的jingzi

為了揭示SSCTjingzi和稀有鮈鯽轉錄組的jingzi在分子水平上的差異，通過RNA-seq 進行分析發(fā)現(xiàn)，數(shù)量有限的 54 個 DEG中，47 個 DEG顯著上調(diào) ，上調(diào)的 DEG 主要代表 SSCT jingzi中存在斑馬魚基因組衍生的轉錄本， 7 個 DEG顯著下調(diào)。

令我們吃驚的是，47 DEG 中的大多數(shù)在 SSCT jingzi樣本中表現(xiàn)出*的表達水平，表明斑馬魚性腺體細胞的一些轉錄產(chǎn)物可能通過某種方式被轉運到了SSCTjingzi細胞中，從而影響了“借腹生殖"所產(chǎn)生的稀有鮈鯽jingzi的形態(tài)和行為特征。

為了揭示DEGs參與了哪些生物學功能，我們對上調(diào)的DEGs進行了基因本體（GO）富集分析，發(fā)現(xiàn)unigenes可以顯著富集到幾個功能項中，例如核糖核蛋白復合物生物發(fā)生、肌動蛋白聚合或解聚，以及對氧化應激的反應（圖 8C）。SSCT jingzi中斑馬魚衍生轉錄本的存在可能是 SSCT jingzi和jingzi之間的形態(tài)和行為差異的原因。

圖8 SSCT jingzi和jingzi之間的轉錄組學差異

三、討論

近來，通過結合CRISPR/Cas9基因敲除和PGCs移植技術，我們成功地生成了F1代純合突變致死基因的斑馬魚母源合子突變體。在目前的研究中，通過利用魚類SSCT實現(xiàn)了亞科物種間的“借腹生殖"，并成功獲得了跨亞科物種來源的經(jīng)基因編輯的SSCT jingzi，這是第一份關于通過兩種魚類之間的替代親體技術生產(chǎn)基因組編輯配子的報告，為斑馬魚母源基因的功能研究開辟了一條新的途徑。

在以往的魚類替代生殖研究中，不同來源的供體細胞已被用于種系移植，如含 PGC 的胚盤細胞、單個 PGC、SSC 或 OSC，并開發(fā)了不同的移植方法，如腹腔移植魚幼蟲和生殖器孔移植到成魚。已有研究表明，不同種系供體和移植方法的不同組合可實現(xiàn)不同個體或不同物種間的移植，且成功率通常與供體物種與宿主物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關系距離呈負相關。在所有組合中，SSCT進入魚幼蟲腹腔被認為是替代繁殖的可選策略，因為SSC可以很容易地分離、培養(yǎng)、冷凍保存甚至在冷凍保存后擴展。然而，當供體和宿主物種來自不同的亞科或系統(tǒng)發(fā)育距離較長的兩個物種時，尚未有成功的SSCT報道。

在本研究中，雖然斑馬魚和稀有鮈鯽來自不同的亞科，甚至這兩種魚的繁殖時間也不同（稀有鮈鯽通常在晚上產(chǎn)卵，而斑馬魚在早上產(chǎn)卵），我們證明稀有鮈鯽SSCs 可以在宿主斑馬魚中成功定殖、增殖和分化，終導致有效產(chǎn)生功能性jingzi的斑馬魚。 通過生殖細胞誘導、SSCs分離、SSCT成功指標綜合評價等一系列優(yōu)化步驟，顯著優(yōu)化了SSCT的成功率。因此，我們的研究進一步將 SSCT 的成功擴展到了屬于不同亞科的兩個系統(tǒng)發(fā)育較遠的物種。

GSCs 在代理宿主中的定殖、增殖和分化的進程對于代理繁殖的終成功至關重要，因此應清楚地描述和表征這一進程的每一步。然而，在以前的魚類替代繁殖研究中，這種生物學過程很少被描述和研究。我們的研究中，通過使用組織學的組合、免疫化學以及 RNA技術，廣泛研究了替代性腺的發(fā)育，并將其與宿主斑馬魚和供體的發(fā)育進行了比較。

研究表明，替代精巢的發(fā)育時間和整體形態(tài)與宿主斑馬魚相似，替代精巢是由來自稀有鮈鯽和斑馬魚的精巢體細胞（Leydig 細胞和 Sertoli 細胞），這進一步揭示了控制不同魚類精巢發(fā)育和jingzi發(fā)生的信號通路的保守性。

在“借腹生殖"技術領域，限制其廣泛應用的主要障礙應該是GSCT的低成功率。為了獲得高的 SSCT 成功率，我們從供體和宿主兩個方面對技術進行了優(yōu)化。一方面，我們發(fā)現(xiàn) 4 dpf 幼蟲適合替代宿主，因為 SSCT 后可以同時獲得相對較高的生育率和可接受的死亡率，這就解決了之前遇到的存活率和移植效率之間的悖論；另一方面，將 mRNA 注射到供體胚胎中以誘導額外的 PGC，當 4 dpf 斑馬魚幼蟲作為受體時，異種 SSCT 的成功率提高到 31.7%。該數(shù)據(jù)高于使用 2 周齡不育雜交幼蟲作為受體的斑馬魚同種異體卵巢生殖細胞移植 (OGCT) 獲得的成功率 (18%)，甚至略高于斑馬魚同種異體 SSCT 在使用白消安治療的成體作為接受者時 (30%)，或 9–10 dpf 死路- 敲除幼蟲作為接受者 (5%) 。為了進一步提升SSCT技術的成功率，體外- 擴增的 SSC 可能被視為異種 SSCT 的供體，并且免疫缺陷宿主可用于維持 SSCT 性腺發(fā)育中的免疫穩(wěn)態(tài)。

在我們的研究中，RNA-seq 分析表明 SSCT jingzi中存在源自斑馬魚的轉錄本，表明 SSCT 精巢中 RNA 的體細胞到種系傳遞，類似于小鼠精巢發(fā)育中的一些新發(fā)現(xiàn)，以及C. 線蟲 。需要進一步研究以確定性腺體細胞轉錄的 RNA 如何轉運到 SSCT jingzi中，以及轉運的 RNA 如何影響 SSCT jingzi的發(fā)育、形態(tài)和功能。該研究也是利用“借腹生殖"技術產(chǎn)生異種來源的基因編輯配子，這為利用該技術定制未來養(yǎng)殖魚類的配子奠定了堅實的理論和實驗基礎。

文丨Fenghua Zhang, Yongkang Hao, Xianmei Li, Yi Li, Ding Ye, Ru Zhang,Xiaosi Wang, Mudan He, Houpeng Wang, Zuoyan Zhu & Yonghua Sun

來源丨部分內(nèi)容綜合自《中國科學雜志社》

DOI丨doi、org/10.1007/s11427-021-1989-9