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核心摘要 ：哺乳動(dòng)物模型（包括非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬和嚙齒動(dòng)物在內(nèi)）已被廣泛用于研究心臟疾病的機(jī)制。然而，越來(lái)越多的人希望替代性模型系統(tǒng)能夠在替代或減少哺乳動(dòng)物使用的同時(shí)提供科學(xué)價(jià)值。

在這里，我們回顧了斑馬魚(yú)在心臟疾病上的研究。我們比較了斑馬魚(yú)和哺乳動(dòng)物心血管系統(tǒng)的解剖學(xué)和生理學(xué)，并描述了斑馬魚(yú)模型在研究心臟機(jī)制（例如:先天性心臟缺陷、心肌病、傳導(dǎo)障礙和再生)，并描述了斑馬魚(yú)的幾個(gè)特征，使其成為治療心臟疾病的體內(nèi)篩選化合物的令人信服的模型。

一、引言

這篇綜述的目的是對(duì)斑馬魚(yú)心臟疾病模型的使用進(jìn)行概述。我們比較了斑馬魚(yú)和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的解剖學(xué)和生理學(xué)，并總結(jié)了斑馬魚(yú)的心臟病理模型，重點(diǎn)是先天性心臟缺陷，心肌病，傳導(dǎo)障礙和再生。

二、斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物：生理學(xué)上的比較

由于它們只有一個(gè)循環(huán)系統(tǒng)，斑馬魚(yú)有一個(gè)由一個(gè)心房和一個(gè)心室組成的兩室心臟，通過(guò)調(diào)節(jié)血壓的動(dòng)脈球連接到鰓血管系統(tǒng)。成年斑馬魚(yú)心臟除了缺乏室間隔和存在硬骨魚(yú)特異性的球形動(dòng)脈外，與吸熱脊椎動(dòng)物心臟相比，它的心臟也是高度小梁化的，心室壁的致密心肌相對(duì)較少。

盡管與哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚(yú)心臟相對(duì)簡(jiǎn)單，但大多數(shù)特殊的細(xì)胞類型和結(jié)構(gòu)(如起搏器、房室瓣、主動(dòng)脈瓣、小梁和冠狀血管)和起作用的細(xì)胞類型(心肌、心內(nèi)膜、心外膜、心臟神經(jīng)嵴、第二心野和成纖維細(xì)胞)都保留著。類似地，信號(hào)傳導(dǎo)通路和驅(qū)動(dòng)早期心臟發(fā)育的形態(tài)發(fā)生過(guò)程也被很好地保留著，斑馬魚(yú)現(xiàn)在被廣泛用作研究心臟發(fā)育和形態(tài)發(fā)生的模型。

斑馬魚(yú)越來(lái)越多地用于分析心臟功能障礙。斑馬魚(yú)的心率比其他模式生物的心率更類似于人類，成年斑馬魚(yú)的心電圖分析識(shí)別出清晰的P、QRS和T波，QT持續(xù)時(shí)間表明復(fù)極時(shí)間相當(dāng)，證明成年斑馬魚(yú)心臟的電生理與人類高度相似。盡管胚胎斑馬魚(yú)心臟很小，但已經(jīng)開(kāi)發(fā)了測(cè)量胚胎心電圖譜的技術(shù)，從受精后3天(dpf)開(kāi)始識(shí)別與在成年斑馬魚(yú)中觀察到的相似的心電圖特征。由于斑馬魚(yú)是變溫動(dòng)物，這些電生理動(dòng)力學(xué)取決于溫度，因此，斑馬魚(yú)心臟電活動(dòng)的比較分析是受溫度控制的，這一點(diǎn)很重要。

斑馬魚(yú)和人類心臟之間ECG活動(dòng)的相似性，特別是不同的 QT 間期，是由于高度可比的心室動(dòng)作電位(AP)，斑馬魚(yú)和人類在復(fù)極期間在正電壓下都表現(xiàn)出長(zhǎng)平臺(tái)期。許多控制人類AP動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵離子通道在斑馬魚(yú)中都有直系同源物，例如，由SCN5A編碼的Na+通道，內(nèi)向整流器 IK,ACh K+通道由KCNJ3和KCNJ5編碼，外向整流IKr K+通道由KCNH2編碼。然而，人類和斑馬魚(yú)AP動(dòng)力學(xué)和通道組成或功能之間也存在關(guān)鍵差異，物種之間的心房AP不太相似，內(nèi)向整流器IK1通道的組成不同，并且沒(méi)有延遲整流電流I Ks編碼基因。盡管這些相似之處使斑馬魚(yú)成為了解人類心臟電生理學(xué)的非常合適的模型，但在藥理分析期間應(yīng)牢記離子通道組成的變化和AP動(dòng)力學(xué)的細(xì)微差異。

三、斑馬魚(yú)心臟疾病模型

斑馬魚(yú)已被用于模擬心臟發(fā)育、功能和疾病的許多方面。在這里，我們重點(diǎn)介紹了斑馬魚(yú)對(duì)我們對(duì)心臟缺陷的理解做出了重大貢獻(xiàn)的具體例子，以及用于生成和詢問(wèn)這些模型的遺傳和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

先天性心臟缺陷(CHD)是常見(jiàn)的出生缺陷，包括一系列結(jié)構(gòu)畸形，包括間隔缺陷、流入和流出道畸形、腔室發(fā)育不全和瓣膜發(fā)育不全等。盡管與具有雙循環(huán)系統(tǒng)的哺乳動(dòng)物的四腔心臟相比，斑馬魚(yú)的兩腔心臟相對(duì)簡(jiǎn)單，但斑馬魚(yú)心臟發(fā)育的分子調(diào)控和形態(tài)發(fā)生過(guò)程是高度保守的。在這里，我們重點(diǎn)介紹斑馬魚(yú)為CHD病因提供新見(jiàn)解的具體例子。

異位癥綜合征是由胚胎發(fā)生過(guò)程中身體左右模式的擾動(dòng)引起的，導(dǎo)致器官側(cè)化的一致性喪失和器官系統(tǒng)內(nèi)部不對(duì)稱的破壞。心臟是高度不對(duì)稱的器官，正確的不對(duì)稱形態(tài)發(fā)生對(duì)于正確的心臟功能至關(guān)重要。因此，異位性個(gè)體經(jīng)常出現(xiàn) CHD。調(diào)節(jié)胚胎不對(duì)稱早期建立的途徑中的關(guān)鍵參與者已經(jīng)確立，斑馬魚(yú)突變體表現(xiàn)出與同源基因突變患者相似的異性表型（圖 1）。

近來(lái)的研究在候選基因中發(fā)現(xiàn)了可能導(dǎo)致異性戀的新變異，通過(guò)CRISPR-Cas9 介導(dǎo)的胚胎誘變進(jìn)行功能驗(yàn)證，確認(rèn)dnah10、rnf115、flna、kif7和kmt2d可調(diào)節(jié)心臟不對(duì)稱。斑馬魚(yú)突變模型還闡明了攜帶CFAP53突變的個(gè)體CHD的潛在機(jī)制，編碼纖毛蛋白。CHD表型的遺傳學(xué)是復(fù)雜的，這突出了斑馬魚(yú)在剖析心臟形態(tài)發(fā)生基礎(chǔ)的通路和相互作用方面的價(jià)值。

圖1 先天性心臟缺陷的斑馬魚(yú)模型。斑馬魚(yú)的先天性心臟缺陷通常在 2 dpf 時(shí)進(jìn)行分析，此時(shí)心臟已經(jīng)歷初始循環(huán)形態(tài)發(fā)生并位于蛋黃上方、腹側(cè)和頭部后方?？梢詤^(qū)分心房 (A) 和心室 (V) 的形態(tài)，并且可以看到房室管和流出道。異位性表型可以通過(guò)心臟環(huán)狀形態(tài)的方向性來(lái)評(píng)估，心臟通常在正常左右模式下經(jīng)歷d環(huán)（原位），但可以反轉(zhuǎn)（s環(huán)）或保持在中線（無(wú)環(huán)）如果胚胎側(cè)向性被破壞。

斑馬魚(yú)是研究環(huán)境因素對(duì)心臟發(fā)育影響的對(duì)應(yīng)模型。PM2.5是細(xì)顆粒物，在空氣質(zhì)量差或污染嚴(yán)重的城市地區(qū)發(fā)現(xiàn)了高水平的顆粒物。PM2.5與CHD發(fā)病率增加有關(guān)，斑馬魚(yú)胚胎暴露于PM2.5會(huì)導(dǎo)致發(fā)育性心臟缺陷，包括心臟畸形和心動(dòng)過(guò)緩。

該模型已被用于識(shí)別可改善PM2.5對(duì)心臟影響的化合物，例如葉酸。葉酸對(duì)發(fā)育性心臟缺陷的保護(hù)作用也在胎兒酒精譜系障礙的斑馬魚(yú)模型中有所描述，這證明了早期發(fā)育過(guò)程中持續(xù)接觸酒精對(duì)心臟形態(tài)和生長(zhǎng)的負(fù)面影響。斑馬魚(yú)也被用來(lái)模擬妊娠期糖尿病/高血糖對(duì)心臟發(fā)育的影響?？傊?，斑馬魚(yú)可以模擬遺傳或環(huán)境起源的CHD的機(jī)制。

心肌病代表一系列心臟病，包括心肌的結(jié)構(gòu)變化，包括三個(gè)主要類別。擴(kuò)張型心肌病(DCM)是一種進(jìn)行性疾病，其特征是心室擴(kuò)大（通常為左心室）、心肌壁變薄和心輸出量減少。肥厚型心肌病(HCM)與心室壁增厚有關(guān)。致心律失常性心肌病(ACM)涉及心肌細(xì)胞的變性，并逐漸被纖維脂肪瘢痕組織替代，影響心臟功能并導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性心臟重塑。通常，心臟功能逐漸受損，常常導(dǎo)致心力衰竭。心肌病和心力衰竭的標(biāo)志在斑馬魚(yú)中是保守的，包括與心肌病和心力衰竭相關(guān)的基因的上調(diào)，例如nppa/nppb。因此，斑馬魚(yú)的研究通過(guò)對(duì)新型心肌病候選基因的功能驗(yàn)證，促進(jìn)了我們對(duì)心肌病潛在機(jī)制的理解（圖 2）。例如，2015年的一項(xiàng)研究描述了胚胎和成年斑馬魚(yú)心臟的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，確定51個(gè)DCM相關(guān)基因中49個(gè)的斑馬魚(yú)同源物。

圖2  心肌病模型。斑馬魚(yú)的心臟收縮力在 24 hpf 左右開(kāi)始，此時(shí)心臟管已形成且肌節(jié)已組裝。隨著心臟發(fā)育，肌絲成熟，48 hpf 的心房和心室心肌細(xì)胞顯示出不同的肌絲組織。心室壁心肌細(xì)胞顯示皮質(zhì)基底肌動(dòng)蛋白，而心房心肌細(xì)胞形成跨越細(xì)胞的長(zhǎng)肌絲，與血流方向垂直。肌節(jié)組裝和功能的中斷導(dǎo)致多種心肌病，以斑馬魚(yú)突變體或錯(cuò)誤表達(dá)模型為代表，包括列出的那些。

TITIN(TTN)編碼一個(gè)巨大的肌節(jié)蛋白，包含沿其長(zhǎng)度的許多蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，這些蛋白與肌節(jié)的Z盤(pán)、I和A帶以及M線區(qū)域相關(guān)聯(lián)。TTN突變導(dǎo)致DCM和骨骼肌病，可能占DCM病例的25%。

然而，TTN基因內(nèi)突變的位置似乎會(huì)影響疾病的嚴(yán)重程度，C末端的突變更可能與深度DCM相關(guān)。斑馬魚(yú)中CRISPR-Cas9介導(dǎo)的靶向突變揭示了為什么截?cái)嗤蛔冊(cè)诎唏R魚(yú)中的位置TTN可能會(huì)影響疾病的嚴(yán)重程度。在后一項(xiàng)研究中，作者在斑馬魚(yú)ttnb基因（類似于人類TTN）中產(chǎn)生了六種不同的截?cái)嗤蛔?，?dǎo)致z盤(pán)、近/中I帶域或遠(yuǎn)端A帶域中的截?cái)?。盡管所有突變都表現(xiàn)出降低的心臟功能，但具有C端截?cái)嗟耐蛔凅w也顯示出骨骼肌肌節(jié)受損和癱瘓。

在ttnb的內(nèi)含子中鑒定了一個(gè)額外的啟動(dòng)子，它產(chǎn)生一個(gè)短的ttnb僅編碼蛋白質(zhì)C端的轉(zhuǎn)錄物，其在骨骼肌中的表達(dá)水平高于心肌。因?yàn)檫@種較短的C端轉(zhuǎn)錄物仍然在N端截?cái)嗳L(zhǎng)ttnb的胚胎中表達(dá)，這可以解釋為什么N端ttnb突變主要導(dǎo)致心臟缺陷，而影響兩種轉(zhuǎn)錄物的C端突變導(dǎo)致在心臟和骨骼缺陷。這個(gè)內(nèi)部啟動(dòng)子在小鼠中是保守的，而且，這個(gè)推定的啟動(dòng)子區(qū)域的位置位于導(dǎo)致人類TTN基因表型嚴(yán)重程度不同的等位基因之間的邊界，提供了為什么遺傳的位置的見(jiàn)解病變?cè)赥TN可能導(dǎo)致DCM的嚴(yán)重程度。

BLC2相關(guān)的athanogene 3(BAG3)編碼與DCM相關(guān)的熱休克蛋白共伴侶。起初，嗎啉介導(dǎo)的斑馬魚(yú)bag3敲低是在 DCM 中識(shí)別BAG3 CNV后進(jìn)行的，導(dǎo)致心包水腫和胚胎縮短部分減少，證實(shí)了心臟功能對(duì)Bag3的要求。然而，穩(wěn)定的斑馬魚(yú)bag3突變體的產(chǎn)生表明，雖然對(duì)于胚胎心臟功能來(lái)說(shuō)可有可無(wú)，但在成年期需要bag3。這以成人bag3為例斑馬魚(yú)突變體在6個(gè)月時(shí)表現(xiàn)出心臟功能下降和運(yùn)動(dòng)耐量降低，這與BAG3致病性變異患者的DCM發(fā)病年齡一致。

此外，從解剖的bag3突變斑馬魚(yú)心臟中分離出的單個(gè)肌原纖維的功能分析揭示了收縮力不足的缺陷，這是一種與DCM而不是HCM相關(guān)的表型，允許對(duì)bag3突變體中的心肌病進(jìn)行分類，類似于患者所采用的。組合bag3/mTor斑馬魚(yú)突變體的比較分析表明，mTor信號(hào)傳導(dǎo)的減少可以部分挽救在bag3突變體（Ding等，2019）。這表明mTor代表了bag3相關(guān)DCM的候選治療靶點(diǎn)，并且bag3突變體可能代表了一種合適的模型來(lái)篩選新化合物以減輕與BAG3突變相關(guān)的DCM。

層粘連蛋白/整聯(lián)蛋白/整聯(lián)蛋白連接激酶(ILK)軸將細(xì)胞外基質(zhì)連接到細(xì)胞骨架。斑馬魚(yú)的識(shí)別之流突變體，表現(xiàn)出DCM的標(biāo)志，所提供的第一個(gè)證據(jù)中斷到層粘連蛋白/整聯(lián)蛋白信號(hào)可能導(dǎo)致心肌病。的靶向測(cè)序LAMA4和ILK的DCM隊(duì)列隨后揭示了一個(gè)錯(cuò)義突變ILK和10點(diǎn)的變體LAMA4其用DCM聯(lián)，代表粘連的第一識(shí)別/整聯(lián)用DCM相關(guān)的突變。

ILK中的雜合突變近來(lái)也與ACM相關(guān)。在這種情況下，表達(dá)野生型或疾病變體人ILK-GFP融合體的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的產(chǎn)生表明，這些ILK變體在3 dpf時(shí)導(dǎo)致部分縮短，而特定變體導(dǎo)致幼年階段死亡。另一個(gè)斑馬魚(yú)ilk突變體等位基因，主擠壓(msq)，在ILK的激酶結(jié)構(gòu)域中攜帶突變，盡管msq突變體中尚未描述DCM，但它們確實(shí)存在心臟收縮性缺陷。蛋白激酶B(PKB)磷酸化在msq突變體中下調(diào)。

然而，注射組成型活性PKB可以恢復(fù)心臟收縮力，表明PKB磷酸化是心臟發(fā)育所必需的。隨后的一項(xiàng)研究利用了這一點(diǎn)，通過(guò)使用msq突變體作為篩選可以恢復(fù)收縮功能的化合物的工具，確定花萼A和岡田酸作為可以恢復(fù)msq突變體中心室部分縮短的藥物，以及部分恢復(fù)PKB磷酸化。

執(zhí)行靶向敲低、創(chuàng)建疾病特異性突變或過(guò)度表達(dá)疾病變異的能力使斑馬魚(yú)成為驗(yàn)證與DCM、HCM和ACM相關(guān)的新候選基因的寶貴模型。除了上述更好表征的基因或通路外，斑馬魚(yú)的功能研究還確定了多種基因在心肌病中的新作用，例如Raf1、Taf1a和Asn。斑馬魚(yú)DCM模型也已通過(guò)給予K+通道阻滯劑特非那定的藥理誘導(dǎo)產(chǎn)生胚胎，而ACM的斑馬魚(yú)模型是使用心肌細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的斑珠蛋白疾病變異體的表達(dá)開(kāi)發(fā)的，導(dǎo)致早期成魚(yú)的心臟肥大和心房和心室壁變薄。通過(guò)將該ACM模型與nppa:熒光素酶轉(zhuǎn)基因品系（在ACM斑馬魚(yú)心臟中上調(diào)）相結(jié)合，篩選了化學(xué)文庫(kù)中可以改變ACM模型中nppa上調(diào)以及潛在拯救心臟功能的化合物。這種方法確定化合物SB216763，一種GSK-3抑制劑，可以使ACM模型中觀察到的動(dòng)作電位缺陷正?；怀隽税唏R魚(yú)模型對(duì)潛在治療劑進(jìn)行功能篩選的易處理性，這些治療劑可以減輕DCM型表型。

傳導(dǎo)障礙包括多種病理，其確切性質(zhì)取決于整個(gè)心臟中電脈沖的產(chǎn)生或傳播如何被破壞。盡管與哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚(yú)心臟的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，但成年斑馬魚(yú)的心電圖分析表明，成年斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位動(dòng)力學(xué)與人類高度相似（圖 3）。近來(lái)對(duì)斑馬魚(yú)心電圖的改進(jìn)包括溫度考慮和麻醉方案的改進(jìn)，很大限度地減少環(huán)境因素對(duì)動(dòng)作電位分析的影響，優(yōu)化探頭定位和打開(kāi)心包囊以提高信噪比。這些努力標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)量并建立ECG參數(shù)的基線變化，可以更詳細(xì)地分析衰老動(dòng)物、心律失常遺傳模型或副交感神經(jīng)系統(tǒng)抑制時(shí)心律失常如何發(fā)展?？梢酝ㄟ^(guò)超聲心動(dòng)圖捕獲和量化胚胎和成人的心臟收縮力，而心臟性能也通過(guò)使用游泳隧道的運(yùn)動(dòng)耐力間接測(cè)量，其中成年斑馬魚(yú)在流速增加的水流中進(jìn)行定時(shí)游泳，并記錄到疲憊的時(shí)間。

圖3  心臟傳導(dǎo)缺陷的斑馬魚(yú)模型。胚胎和成年斑馬魚(yú)心臟的心電圖記錄與從人類獲得的心電圖記錄非常相似，具有可區(qū)分的 P 波、QRS 波群和 T 波，允許量化比較參數(shù)，如 QT 間期。長(zhǎng) QT 綜合征和短 QT 綜合征（LQTS 和 SQTS）均可由鉀通道kcnh2中的突變引起，并分別由斑馬魚(yú)霹靂舞和雷鬼突變體建模。心臟起搏缺陷，如心房顫動(dòng)（AF，失去規(guī)律的竇性心律）和病態(tài)竇房結(jié)綜合征（SSS，有缺陷的竇性起搏，包括竇性暫停）也已使用斑馬魚(yú)功能喪失和錯(cuò)誤表達(dá)模型進(jìn)行建模。

除了斑馬魚(yú)和人類心肌細(xì)胞動(dòng)作電位之間的相似性之外，斑馬魚(yú)心臟的傳導(dǎo)動(dòng)力學(xué)也對(duì)人類使用的通道阻滯劑和激活劑以及異丙腎上腺素和去甲腎上腺素等敏感。許多這類化合物對(duì)心臟功能或傳導(dǎo)的影響類似于在人類中觀察到的那些。施用刺激交感神經(jīng)調(diào)節(jié)心臟功能的化合物，如去甲腎上腺素或異丙腎上腺素，會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)心動(dòng)過(guò)速，而阿托品會(huì)抑制副交感神經(jīng)輸入，也會(huì)增加心率。

離子通道調(diào)節(jié)劑對(duì)斑馬魚(yú)的心臟傳導(dǎo)有影響，類似于在人類中看到的那些。暴露于影響鉀通道的化合物的胚胎的ECG分析揭示了對(duì)乙酰膽堿和卡巴膽堿，而給予E4031、白藜蘆醇、特非那定、氟哌啶醇、苯海拉明和奧芬那君( hERG/KCNH2 K+通道阻滯劑)會(huì)延長(zhǎng)動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間(APD)和QT間期。

動(dòng)作電位動(dòng)力學(xué)分析表明，鈉通道阻滯劑減少AP上行，而L型鈣通道阻滯劑硝苯地平縮短平臺(tái)期，塑造AP持續(xù)時(shí)間。硝苯地平和鈣通道拮抗劑維拉帕米均誘導(dǎo)心動(dòng)過(guò)緩，而B(niǎo)ayK8644（L型鈣通道激活劑）延長(zhǎng)QT間期。在某些情況下，這些化合物還會(huì)以濃度依賴的方式誘發(fā)額外的心臟缺陷，包括心律失常和房室傳導(dǎo)阻滯。在斑馬魚(yú)中也證明了抗心律失常藥物的保守作用，胺碘酮和奎尼丁（這會(huì)導(dǎo)致心動(dòng)過(guò)緩和延長(zhǎng) QT 間期）同樣延長(zhǎng)斑馬魚(yú)的QT間期。

然而，并非所有用于患者的化合物都會(huì)引起相同的反應(yīng)。HMR1556（一種I KS阻滯劑）縮短而不是延長(zhǎng)APD，而QT延長(zhǎng)藥物索他洛爾、紅霉素、奎尼丁和阿米替林在斑馬魚(yú)中沒(méi)有類似作用。這些差異可能是由于離子通道組成或功能的某些差異或化合物吸收不良造成的。這些藥理化合物對(duì)心臟功能的影響可以揭示有關(guān)健康和疾病中心臟電生理學(xué)基礎(chǔ)分子途徑的信息。這通過(guò)額外的成像工具得到增強(qiáng)，例如由心肌啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因編碼鈣傳感器，它能夠?qū)ε咛ズ陀佐~(yú)心臟中的瞬時(shí)鈣動(dòng)力學(xué)進(jìn)行活體成像。光學(xué)電壓映射還提供高分辨率的心臟電生理分析。這可以通過(guò)染料染色、基因編碼電壓傳感器或近來(lái)開(kāi)發(fā)的心肌線粒體ATP傳感器。

長(zhǎng)QT綜合征(LQTS)、心房顫動(dòng)(AF)和病態(tài)竇房結(jié)綜合征(SSS)是在斑馬魚(yú)中建模的傳導(dǎo)缺陷。LQTS的特征是延長(zhǎng)的心肌復(fù)極時(shí)間，通過(guò)QT間期持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)來(lái)診斷。由KCNH2編碼的離子通道Kv11.1，中的突變是LQTS的原因，而斑馬魚(yú)breakdance突變體具有kcnh2突變，表現(xiàn)出在兒科LQTS中觀察到的房室(AV)阻滯的斷裂突變體被用作背景用于化學(xué)屏幕的化合物，其能抑制AV塊。施用2-MMB或類固醇氟代腎上腺素內(nèi)酯可縮短動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間(APD)并挽救breakdance突變體中的AV阻滯，確定了兩種可以縮短心肌復(fù)極化的潛在療法。在將IKr鉀通道阻滯劑特非那定應(yīng)用于外植心臟后，膜片鉗分析顯示kcnh2突變體的AP持續(xù)時(shí)間同樣增加，提供了進(jìn)一步的功能證據(jù)，表明I Kr對(duì)斑馬魚(yú)心室的復(fù)極化至關(guān)重要。

盡管在突變的事實(shí)KCNH2與LQTS相關(guān)的雜合變異KCNH2與短QT綜合征（SQTS）相關(guān)聯(lián)。這種KCNH2變異在斑馬魚(yú)中的表達(dá)揭示了功能獲得表型，解釋了與傳統(tǒng)的LQTS相關(guān)的KCNH2突變相比，該突變對(duì)QT間期的相反影響。斑馬魚(yú)Reggae突變體提供了進(jìn)一步的證據(jù)，表明特定的KCNH2變體可能對(duì)QT間期產(chǎn)生相反的影響。Reggae突變體在kcnh2的電壓感應(yīng)域中存在損傷。

然而，與breakdance突變體不同，Reggae突變體表現(xiàn)出竇阻滯而不是AV阻滯。特非那定的給藥降低了鉀電流并挽救了Reggae突變體的表型，表明病變導(dǎo)致功能獲得。支持這一點(diǎn)的是，Reggae突變體的動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間顯著減少，QT間期較短。因此，breakdance和Reggae突變體代表了LQTS和SQTS的斑馬魚(yú)模型，Reggae雷鬼代表第一個(gè)描述的SQTS動(dòng)物模型的突變體（圖3）。

AF的特征是不規(guī)則的心房起搏和經(jīng)常增加的心率。斑馬魚(yú)中的增強(qiáng)子分析確定了假定的PITX2c調(diào)控序列，這些序列與人類中包含常見(jiàn)AF相關(guān)單核苷酸多態(tài)性 (SNP)的遺傳區(qū)域重疊，表明PITX2的失調(diào)可能是AF的原因。成年pitx2c斑馬魚(yú)突變體的心電圖分析顯示心臟功能受損，伴有心房擴(kuò)大和心房纖維化增加。這表明PITX2c變異可能是AF的一個(gè)致病因素。

病態(tài)竇房結(jié)綜合征(SSS，也稱為竇房結(jié)功能障礙)，當(dāng)竇房結(jié)（心臟的起搏器）無(wú)法產(chǎn)生規(guī)律的生理心率而導(dǎo)致心律失常時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)病態(tài)竇房結(jié)綜合征。GNB5是一種鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白亞基，參與向內(nèi)向整流鉀通道募集蛋白質(zhì)，已在患有早發(fā)性竇房結(jié)功能障礙的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)突變。碳酰膽堿和異丙腎上腺素對(duì)斑馬魚(yú)gnb5突變體的影響分析表明，GNB5是副交感神經(jīng)控制心率所必需的，但不是交感神經(jīng)控制所必需的。這表明GNB5的丟失將與靜息時(shí)極度心動(dòng)過(guò)緩有關(guān)——這一發(fā)現(xiàn)與GNB5突變患者的靜息心率異常低一致（Lodder等，2016）。斑馬魚(yú)研究驗(yàn)證了在常染色體顯性緩慢性心律失常家族中鑒定的KCNJ3變異的功能獲得活性，并證明施用IKACh通道阻滯劑NIP-151可改善斑馬魚(yú)模型中的緩慢性心律失常表型。

功能測(cè)量、傳導(dǎo)傳感器和基因突變體都提供了合適的背景，可用作藥理學(xué)篩選的基礎(chǔ)，識(shí)別與心臟傳導(dǎo)有關(guān)的新基因或改變傳導(dǎo)動(dòng)力學(xué)的化合物。進(jìn)行了近300個(gè)插入突變體的篩選，以確定調(diào)節(jié)心臟傳導(dǎo)的新基因和途徑。將陽(yáng)性結(jié)果與LQTS相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉匹配，揭示了有絲分裂調(diào)節(jié)因子Gins3在動(dòng)作電位動(dòng)力學(xué)中的新作用。

在另一項(xiàng)研究中，篩選可恢復(fù)震顫突變體（鈉鈣交換劑Ncx1具有不穩(wěn)定心臟收縮力的突變體）表明，用efsevin治療可以恢復(fù)穩(wěn)定的鈣瞬變和細(xì)胞偶聯(lián)，從而挽救心臟功能。

3.1 斑馬魚(yú)心臟再生模型

心肌梗塞(MI)后，人類無(wú)法補(bǔ)充丟失的心肌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致持續(xù)性瘢痕形成、心臟功能受損、心臟重塑，并導(dǎo)致心力衰竭。盡管成年小鼠心臟的再生潛力有限，但新生小鼠心臟能夠產(chǎn)生再生反應(yīng)。

然而，這種能力在產(chǎn)后7天就會(huì)喪失，對(duì)接受心室切除術(shù)的新生小鼠的長(zhǎng)期隨訪表明長(zhǎng)期瘢痕形成以及擴(kuò)張型心肌病。

相反，斑馬魚(yú)能夠在受傷后*再生他們的心臟，為了解提高人類再生潛力的分子機(jī)制提供了一個(gè)寶貴的模型。斑馬魚(yú)的心臟再生模型對(duì)再生背后的時(shí)間過(guò)程以及支持這些反應(yīng)的分子機(jī)制提供了重要的見(jiàn)解。損傷后3小時(shí)(hpi)的早期反應(yīng)包括促炎分子的表達(dá)和免疫的募集細(xì)胞，這對(duì)疤痕沉積和隨后的再生反應(yīng)很重要。同時(shí)，未受傷組織中的心內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化并重新表達(dá)發(fā)育基因。

在炎癥和心內(nèi)膜激活發(fā)生后，心內(nèi)膜和心外膜是進(jìn)行大規(guī)模再生的細(xì)胞層。在3到5dpi之間，損傷部位周圍的心內(nèi)膜細(xì)胞增殖，然后遷移到覆蓋傷口區(qū)域的內(nèi)表面。冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建在損傷后迅速啟動(dòng)，血管網(wǎng)絡(luò)需要促進(jìn)再生。再生心臟的心電圖分析表明，盡管再生過(guò)程中QT間期延長(zhǎng)，但動(dòng)作電位動(dòng)態(tài)在再生后恢復(fù)正常。

已經(jīng)建立了幾種斑馬魚(yú)心臟損傷模型（圖4），心室截肢捕獲心臟進(jìn)行再生的能力，形成纖維蛋白凝塊，在30-60 dpi內(nèi)逐漸被肌肉取代（Poss等，2002；Raya等，2003）。心肌梗塞在炎癥和纖維化的同時(shí)誘導(dǎo)多種細(xì)胞類型的死亡。因此，再生不僅需要替換丟失的心肌細(xì)胞，還需要去除死細(xì)胞、基質(zhì)重塑、血運(yùn)重建和心臟機(jī)電耦合的重建（Frangogiannis,2006）。這可以通過(guò)冷凍損傷在斑馬魚(yú)中建模，冷凍損傷導(dǎo)致心室受損部分大量局部細(xì)胞死亡，導(dǎo)致所有心臟細(xì)胞類型的細(xì)胞凋亡，并復(fù)制MI后發(fā)生的心臟壞死（Gonzalez-Rosa等，2011）。誘導(dǎo)型基因消融模型，其中細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)白喉毒素(DTA)或硝基還原酶（一種將甲硝唑轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性劑的酶）的表達(dá)，提供了對(duì)不同細(xì)胞類型如何促進(jìn)心臟再生的進(jìn)一步機(jī)制見(jiàn)解。

圖4  斑馬魚(yú)再生模型。斑馬魚(yú)心臟在受傷后能夠*再生。在切除模型中，心室心尖被截?cái)?，?dǎo)致形成纖維蛋白凝塊，新的心臟組織在 60 天內(nèi)生長(zhǎng)。在冷凍損傷模型中，冷凍探針應(yīng)用于心室，導(dǎo)致局部細(xì)胞死亡。隨后發(fā)生炎癥和細(xì)胞碎片清除，并在損傷部位形成疤痕。大約 120 天后疤痕消失，心臟再生。

有趣的是，盡管對(duì)冷凍損傷的再生反應(yīng)很強(qiáng)，但疤痕吸收會(huì)隨著反復(fù)損傷而減弱，并且在六次冷凍損傷后，心臟無(wú)法解決纖維化組織（Bise等，2020）。雖然這表明心臟可以在多次損傷后再生（多次損傷后心肌細(xì)胞本身的再生能力似乎不會(huì)受到影響），但它表明用新的心肌細(xì)胞替代纖維化組織的能力是有限的。多重?fù)p傷模型提供了將促再生程序與纖維化和疤痕消退的程序分開(kāi)的機(jī)會(huì)，這可能對(duì)改善MI中的心臟功能有影響，盡管心臟存在疤痕。

斑馬魚(yú)遺傳和再生模型的結(jié)合還可以深入了解心臟功能障礙如何改變?cè)偕芰?，以及如何開(kāi)發(fā)治療劑以提高這種能力。斑馬魚(yú)霹靂舞突變體LQTS模型的心臟再生受損，與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積增加和過(guò)度炎癥相關(guān)。盡管在該模型中施用炎性化合物如地塞米松或 MMP 抑制劑可促進(jìn)疤痕消退和再生，但再生過(guò)程中免疫反應(yīng)的時(shí)間和演變可能對(duì)介導(dǎo)再生至關(guān)重要。而斑馬魚(yú)代表了一個(gè)很好的模型，可以直接研究如何操縱免疫反應(yīng)來(lái)促進(jìn)人類的再生。

同樣，靶向ECM重塑代表了一種有前途的治療途徑。2016年的一項(xiàng)研究表明，再生斑馬魚(yú)心臟的ECM在哺乳動(dòng)物非再生模型中具有促進(jìn)再生的作用，表明特定的ECM成分可能是促進(jìn)再生特定方面的關(guān)鍵。與此一致的是，近來(lái)的研究報(bào)告稱，將ECM組分集聚蛋白施用于MI后小鼠和豬心臟可改善心臟再生，證明斑馬魚(yú)的見(jiàn)解可以為制定治療策略奠定基礎(chǔ)。

雖然已經(jīng)使用斑馬魚(yú)對(duì)心臟再生進(jìn)行了重要的了解，但一個(gè)限制在于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)形態(tài)和功能恢復(fù)的能力，依賴于固定組織分析（盡管光片成像有助于在整個(gè)組織環(huán)境中可視化再生）。再生心臟MRI成像的進(jìn)展為評(píng)估同一動(dòng)物隨時(shí)間的再生提供了新的機(jī)會(huì)（Koth等，2017），而開(kāi)發(fā)用于培養(yǎng)外植受傷心臟的流體裝置允許對(duì)血管重建等過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，提供對(duì)再生過(guò)程中特定細(xì)胞相互作用的更詳細(xì)見(jiàn)解。

總體而言，對(duì)斑馬魚(yú)的心臟發(fā)育、功能和再生進(jìn)行實(shí)時(shí)、體內(nèi)分析的能力提供了一個(gè)*的機(jī)會(huì)，來(lái)定義發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)和功能異常與生命過(guò)程中的心臟功能障礙和結(jié)構(gòu)重塑之間的關(guān)系。

文丨George Bowley, Elizabeth KuglerRob, Wilkinson4 | Allan Lawrie, Freek van Eeden, Tim J. A. Chico, Paul C. Evans, Emily S. No?l,Jovana Serbanovic-Canic

翻譯丨郭盟

DOI丨 10.1111/bph.15473