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核心摘要

炎癥性腸病 (IBD) 包括胃腸道(GI)的炎癥，其特征是急性炎癥和緩解期。 IBD 的治療管理仍然存在問題，因?yàn)閷?duì)其發(fā)病機(jī)制了解不*。這項(xiàng)研究的重點(diǎn)是2,4,6-*磺酸 (TNBS) 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎對(duì)成年斑馬魚腸道神經(jīng)元亞群變化的影響。

這些變化被認(rèn)為與改變的神經(jīng)免疫相互作用和 GI 運(yùn)動(dòng)性以及 IBD 發(fā)病機(jī)制有關(guān)。對(duì)神經(jīng)可塑性的新見解將有助于尋找合適的治療方法。在麻醉的成年斑馬魚的遠(yuǎn)端腸 (DI) 中腔內(nèi)注射 TNBS。創(chuàng)建腸道炎癥反應(yīng)的組織學(xué)時(shí)間過程，以建立很好的TNBS 濃度和急性炎癥階段。在整個(gè)裝載上使用雙重免疫標(biāo)記，分析了炎癥對(duì)神經(jīng)元群的影響。基于腸壁增厚、上皮褶皺破壞、杯狀細(xì)胞數(shù)量減少和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，我們的分析表明，誘導(dǎo)非致死性炎癥的很好的TNBS 濃度（320 mM，溶于 25% 乙醇）在誘導(dǎo)后 6 小時(shí)達(dá)到峰值。

炎癥反應(yīng)在誘導(dǎo)后 3 天恢復(fù)到基線值。在急性炎癥階段，未觀察到對(duì)氮能神經(jīng)元分布或比例的影響，而僅膽堿能神經(jīng)元比例在 DI 中顯著降低。炎癥期間整個(gè)腸道中5-羥色胺能神經(jīng)元的比例顯著增加。本研究描述了 TNBS 誘導(dǎo)的成年斑馬魚結(jié)腸炎的方法。鑒于急性炎癥階段伴隨著與IBD患者觀察到的變化相當(dāng)?shù)纳窠?jīng)可塑性，以及斑馬魚的*和多功能特征，允許該模型與IBD動(dòng)物模型一起使用，以解開IBD病理學(xué)并測(cè)試新的IBD療法。

一、引言

炎癥性腸病 (IBD) 的特征是胃腸道(GI)內(nèi)的慢性免疫激活和炎癥，處于急性炎癥和緩解期?？肆_恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是IBD的兩種主要表型。 近年來，大量有關(guān)IBD的知識(shí)被揭示出來。然而，IBD的發(fā)病機(jī)制仍未*了解。到目前為止，我們所知道的是遺傳、環(huán)境、微生物和免疫因素之間存在復(fù)雜的相互作用?；颊邥?huì)出現(xiàn)痙攣、大便急迫、腹瀉、腹痛和體重減輕。IBD或GI炎癥會(huì)影響GI功能，包括運(yùn)動(dòng)、分泌、吸收、腸道屏障功能和感覺。

胃腸功能由自主神經(jīng)系統(tǒng)控制，包括腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)。ENS由存在于胃腸道壁內(nèi)的所有神經(jīng)元組成，并分為兩個(gè)主要的神經(jīng)叢，肌間神經(jīng)叢和粘膜下神經(jīng)叢。ENS包含一組不同的功能神經(jīng)元類型，包括感覺神經(jīng)元、中間神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，它們?cè)谖㈦娐分幸酝挥|方式相互連接。先前在動(dòng)物模型和患者中的研究結(jié)果表明，炎癥會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)變化，包括神經(jīng)變性，在腸神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)叢中，并改變ENS中神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽和受體的表達(dá)。

盡管結(jié)腸炎的動(dòng)物模型并不能*模擬人的IBD，但通過使用2,4,6-*磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的動(dòng)物結(jié)腸炎，已經(jīng)獲得了有關(guān)IBD病理生理學(xué)的大量數(shù)據(jù)。

近年來，斑馬魚越來越多地用于揭示人類疾病模式—包括IBD。斑馬魚作為模式生物具有一些*的特征，例如，大量的后代、較低的維護(hù)成本、*測(cè)序的基因組、大量可用遺傳工具、易于控制的環(huán)境以及先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的存在。已經(jīng)在幼蟲和成年斑馬魚中進(jìn)行了類似于小鼠的基于化學(xué)的結(jié)腸炎誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，使用浸泡、口服微灌胃或直腸內(nèi)給藥。隨后的免疫反應(yīng)、遺傳因素和環(huán)境因素似乎與在哺乳動(dòng)物小腸結(jié)腸炎動(dòng)物模型中觀察到的相似。這些研究在表明小腸結(jié)腸炎的誘發(fā)取決于特定的微生物環(huán)境，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都必須優(yōu)化自己的TNBS模型。本研究側(cè)重于TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎對(duì)成年斑馬魚ENS的影響。不同腸道神經(jīng)元群內(nèi)的變化被認(rèn)為與神經(jīng)免疫相互作用和胃腸動(dòng)力的改變有關(guān)，甚至與IBD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。更好地了解神經(jīng)可塑性將有助于尋找合適的治療方法。

斑馬魚的腸道只有一個(gè)由分散的腸神經(jīng)元組成的非神經(jīng)節(jié)肌間神經(jīng)叢，沒有黏膜下神經(jīng)叢。斑馬魚沒有胃，但近端腸(PI)是儲(chǔ)存和混合食物的場(chǎng)所。接下來是中腸（MI)含有產(chǎn)生粘蛋白的杯狀細(xì)胞和腸細(xì)胞，主要用于營(yíng)養(yǎng)吸收。MI的遠(yuǎn)端部分包含一些假定在腸道免疫中起作用的特化腸細(xì)胞。短遠(yuǎn)端腸(DI)的結(jié)構(gòu)表明其作用類似于哺乳動(dòng)物中的結(jié)腸。以前的研究表明，成年斑馬魚腸道中存在不同的神經(jīng)元亞群，可分為三類：5-羥色胺能、膽堿能和氮能神經(jīng)元。

本研究的目的是通過確定很好的劑量和炎癥的急性期來優(yōu)化我們實(shí)驗(yàn)室條件下成人TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型，并調(diào)查斑馬魚腸道中存在的主要腸道種群的假定神經(jīng)元變化。

二、成年斑馬魚小腸結(jié)腸炎的誘導(dǎo)

雌性斑馬魚（6-8個(gè)月）在0.016% MS222（Western Chemical Inc.,Ferndale,WA,USA）中麻醉3分鐘，稱重、測(cè)量并放置在濕紙巾上。

腹部被輕輕擠壓以增強(qiáng)直腸開口的可視化。使用外徑為0.3 mm的Eppendorf GELoader（Eppendorf AG，Hamburg，Germany）柔性將適當(dāng)體積（10 μL/g體重）的注射進(jìn)魚直腸。為了評(píng)估很好的劑量，給魚注射了溶解在25%乙醇中的不同濃度的TNBS（Sigma-Aldrich Corp.,St.Louis,MO,USA）：5 mM、40 mM、80 mM、160 mM、320 mM和640 mM，隨后單獨(dú)放置在通風(fēng)良好的獨(dú)立罐中，用于個(gè)體觀察和生存分析。

對(duì)照組包括僅接受25%乙醇（10 μL/g體重）的載體組和僅接受操作程序的處理組（對(duì)照組）。這部分研究中的每個(gè)實(shí)驗(yàn)組總是包含15條成年斑馬魚，而兩個(gè)對(duì)照組各包含5只動(dòng)物。

6小時(shí)后，斑馬魚在0.04%MS222中老去，并分塊解剖胃腸道。將腸在含10 mM磷酸鹽緩沖鹽水（PBS；pH 7.4）的4% 多聚甲醛(PFA)中固定過夜，并在PBS中沖洗后，進(jìn)一步加工以包埋在石蠟中。由MI的后部和DI在HM340E切片機(jī)（Microm，Walldorf，Germany）上制成7 μm的連續(xù)切片。

先前已證明成年斑馬魚胃腸道的后部在基于化學(xué)的小腸結(jié)腸炎誘導(dǎo)中受到影響。交替處理切片以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蘇木精和伊紅(H&E)染色，以顯示腸壁的一般形態(tài)，或用于阿爾新藍(lán)/高碘酸席夫(PAS)反應(yīng)檢測(cè)產(chǎn)生粘液的杯狀細(xì)胞和浸潤(rùn)的嗜酸性粒細(xì)胞。使用Olympus DP70相機(jī)（Olympus Belgium NV,Aartselaar,Belgium）對(duì)每個(gè)分析的切片進(jìn)行拍照。檢查了四個(gè)不同的參數(shù)：腸壁的厚度、上皮褶皺結(jié)構(gòu)、杯狀細(xì)胞的數(shù)量和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。使用Image J(NIH, Bethesda, MD)分析圖片。

在每條魚的12個(gè)切片中測(cè)量腸壁的厚度。計(jì)算平均值（以μm為單位）并根據(jù)其增厚進(jìn)行細(xì)分，范圍從0到2（0 =無增厚，≤75 μm；1 =中等增厚，75-95 μm；2 =嚴(yán)重增厚，≥95 μm）。上皮褶皺的結(jié)構(gòu)外觀根據(jù)三類在每只動(dòng)物的12個(gè)切片中進(jìn)行評(píng)級(jí)：0（正常外觀）、1（輕微破壞）或2（嚴(yán)重破壞：增加的褶皺間距和上皮完整性的破壞）。

在每條魚的16個(gè)切片上計(jì)算杯狀細(xì)胞的數(shù)量（1個(gè)框架/切片：一個(gè)框架的表面積：0.13 mm2）。計(jì)算平均值并分配一個(gè)分?jǐn)?shù)：0 = ≥15個(gè)杯狀細(xì)胞；1 = 10到15個(gè)杯狀細(xì)胞；2 = ≤10個(gè)杯狀細(xì)胞。在同一幀上，根據(jù)以下評(píng)分系統(tǒng)對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)進(jìn)行計(jì)數(shù)：0 =幾乎沒有任何嗜酸性粒細(xì)胞存在；1 =中等滲透；2 =嚴(yán)重浸潤(rùn)，特征為濾過細(xì)胞簇。將0至8分的四個(gè)分?jǐn)?shù)相加，得出小腸結(jié)腸炎總體評(píng)分，0至2分表示無炎癥，3至5分表示中度炎癥，6至8分表示嚴(yán)重炎癥。為了確定炎癥的急性期，斑馬魚注射了很好的劑量的TNBS，并在3、6和14小時(shí)、1、3和7天老去。如上所述，將腸切出并進(jìn)行石蠟切片和染色處理。本部分每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各有5條成年斑馬魚。

三、神經(jīng)元群

為了確定神經(jīng)元群可能發(fā)生的變化，在炎癥的急性期進(jìn)行了全腸道準(zhǔn)備。因此，將腸沿腸系膜邊界打開并固定在裝有4% PFA PBS的Sylgard-lined培養(yǎng)皿中，室溫下放置2小時(shí)。固定后，整個(gè)支架在PBS中*清洗，并進(jìn)一步處理以獲得很好的免疫染色，如前所述。簡(jiǎn)而言之，在PBS中漂洗后，將整個(gè)支架在含有0.05%硫柳汞的PBS中孵育1小時(shí)。接下來，在PBS中洗滌后，將它們浸入含有0.1%NaBH-CN的PBS中30分鐘并在PBS中沖洗。如前所述，在室溫下對(duì)整個(gè)安裝制劑進(jìn)行雙重免疫染色。使用的初級(jí)和二級(jí)抗體列于表1中。

嵌入整個(gè)支架后，使用配備Olympus DP70相機(jī)的熒光顯微鏡拍攝圖像。為了研究小腸結(jié)腸炎對(duì)腸神經(jīng)元群的影響，我們對(duì)每個(gè)群使用了5只動(dòng)物，而兩個(gè)對(duì)照組都包含3只動(dòng)物。如前所述，腸道被任意分成三部分：PI、MI和DI。在每個(gè)部分，對(duì)10個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域進(jìn)行拍照，并如前所述手動(dòng)計(jì)數(shù)細(xì)胞。為了定量，每個(gè)視覺框架(8.2x104 μm2)對(duì)免疫反應(yīng)性細(xì)胞體進(jìn)行計(jì)數(shù)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均使用IBM SPSS Statistics 20（IBM，Armonk，NY，USA）進(jìn)行。結(jié)果通過方差分析進(jìn)行分析，然后在適當(dāng)時(shí)進(jìn)行Tukey事后檢驗(yàn)。假設(shè)顯著性為P<0.05。共聚焦圖像是使用PerkinElmer UltraVIEW Vox旋轉(zhuǎn)圓盤共焦系統(tǒng)使用488和 561 nm激光器拍攝的。

表1 一抗和二抗列表，以及它們各自用于免疫組織化學(xué)的稀釋度

四、結(jié)果

1、劑量反應(yīng)

測(cè)試了不同的TNBS濃度以找到用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的很好的劑量。接受5至160 mM劑量的魚沒有死亡（截止6小時(shí)），也沒有表現(xiàn)出嚴(yán)重的不適。然而，使用更高的TNBS濃度，我們觀察到接受320 mM TNBS的魚有73%存活，而分別接受480 mM和640 mM TNBS的魚只有55%和25%存活（圖1）。注射了480 mM和640 mM TNBS的魚遭受了劇烈的疼痛，使用這些劑量的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)被排除在研究之外。此外，在兩個(gè)對(duì)照組中均未觀察到高疼痛評(píng)分或死亡。

【3】

對(duì)誘導(dǎo)后6小時(shí)(hpi)收集的樣品的不同組織切片進(jìn)行評(píng)分顯示，濃度為40、80和160 mM時(shí)出現(xiàn)中度炎癥，而注射320 mM TNBS導(dǎo)致嚴(yán)重炎癥（圖2）。炎癥導(dǎo)致腸壁增厚、上皮結(jié)構(gòu)破壞、杯狀細(xì)胞數(shù)量減少和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加（圖3）。對(duì)照組和載體組的斑馬魚沒有表現(xiàn)出任何炎癥跡象。

有趣的是，在去除腸道期老去后，我們觀察到對(duì)照組和載體組的膽囊呈亮綠色，而在注射40 mM和80 mM TNBS的斑馬魚中變?yōu)樯罹G色，在注射了160 mM和320 mM TNBS的斑馬魚中變?yōu)楹稚?/span>

2、時(shí)間響應(yīng)

為了評(píng)估炎癥的急性期，重復(fù)了相同的實(shí)驗(yàn)。用溶解在25%乙醇中的320 mM TNBS劑量直腸注射魚，并在誘導(dǎo)后3、6和14 hpi、1、3和7天（dpi）處死。組織學(xué)評(píng)分顯示對(duì)TNBS的反應(yīng)非常快（圖 4）。在3 hpi時(shí)，觀察到嚴(yán)重的炎癥跡象（分?jǐn)?shù)= 6）。在6 hpi時(shí)達(dá)到炎癥峰值（分?jǐn)?shù)= 8）。在14 hpi時(shí)，炎癥評(píng)分下降（評(píng)分= 6）。在1 dpi時(shí)，僅觀察到中度炎癥（分?jǐn)?shù)= 4），而在3 dpi時(shí)，炎癥分?jǐn)?shù)降至基線，并在7 dpi時(shí)*恢復(fù)。

3、神經(jīng)元亞群

TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎對(duì)三種腸道神經(jīng)元群的影響在炎癥高峰時(shí)進(jìn)行評(píng)估（劑量為320 mM處理6 hpi）。在發(fā)炎和非發(fā)炎的腸道中，神經(jīng)元密度從腸道的口腔到反面增加，但在比較兩種腸道組織時(shí)，沒有觀察到神經(jīng)元密度的顯著變化（圖6A）。

氮能神經(jīng)元的比例分布在炎癥和非炎癥條件之間沒有顯示任何變化（圖5 A，B和6B）（對(duì)照：PI 23.6±1.2%；MI 23.3±2.7%；DI 22.3±1.6%；總體 23.07±1.8%//TNBS：PI 24.1±2.1%；MI 22.91±2.1%；DI 24.05±2.8%；總體 23.7±1.9%），而膽堿能和5-羥色胺能的比例顯示變化。對(duì)照和TNBS處理的魚中5-羥色胺能神經(jīng)元的比例沿著腸道長(zhǎng)度減少（圖5 C，D和6C）。

相比之下，TNBS處理的魚顯示每個(gè)腸道部分的5-羥色胺能神經(jīng)元比例增加（對(duì)照：PI 23.6±2.5%；MI 18.4±3.0%；DI 11.5±1.9%；總體 17.8±3.1%//TNBS：PI 28.6±2.6%；MI 23.2±1.4%；DI 18.4±1.6%；總體 23.4±1.3%）。在對(duì)照樣本中，膽堿能神經(jīng)元的總體比例為39.3±3.1%，不同腸道區(qū)域之間沒有任何差異。然而，經(jīng)TNBS處理的動(dòng)物在DI中顯示出膽堿能神經(jīng)元比例降低（對(duì)照：38.48±4.6%//TNBS：21.95±2.5%）（圖5 E，F(xiàn)和6D）。

五、討論

基于有關(guān)斑馬魚化學(xué)誘導(dǎo)小腸結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)和建議，我們?cè)诖_定了TNBS的很好的劑量(320 mM)和時(shí)間(6小時(shí))以誘導(dǎo)炎癥的急性期后，優(yōu)化了斑馬魚TNBS誘導(dǎo)的小腸結(jié)腸炎模型。在炎癥的急性期，該模型用于檢查小腸結(jié)腸炎對(duì)ENS的影響。沒有觀察到對(duì)GI壁不同部位的神經(jīng)元密度或氮能腸神經(jīng)元群的比例分布的影響。然而，小腸結(jié)腸炎導(dǎo)致整個(gè)腸道中5-羥色胺能神經(jīng)元比例增加，以及腸道遠(yuǎn)端膽堿能神經(jīng)元比例下降。

評(píng)分系統(tǒng)用于評(píng)估炎癥程度，如先前在哺乳動(dòng)物和斑馬魚模型中描述的胃腸道炎癥。我們對(duì)小腸結(jié)腸炎急性期杯狀細(xì)胞數(shù)量減少的觀察結(jié)果與研究表明，在斑馬魚的遺傳和化學(xué)小腸結(jié)腸炎模型中杯狀細(xì)胞數(shù)量減少甚至耗盡，但與之前的TNBS結(jié)果不一致研究顯示沒有變化，或杯狀細(xì)胞數(shù)量增加。在哺乳動(dòng)物中，杯狀細(xì)胞耗竭的數(shù)據(jù)也不是明確的，有報(bào)道稱杯狀細(xì)胞數(shù)量不變或減少。與之前對(duì)成年斑馬魚的研究一致，我們?cè)谛∧c結(jié)腸炎的急性期觀察到腸壁增厚、上皮破壞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。這些現(xiàn)象也在TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎急性期的嚙齒動(dòng)物模型中得到證實(shí)。人體IBD研究同樣報(bào)告了腸壁增厚和上皮結(jié)構(gòu)破壞。在人類中，嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量及其原位激活在IBD的急性期而非慢性期增加，表明這些粒細(xì)胞在觀察到的病理癥狀中起關(guān)鍵作用。

總之，本研究描述了一種化學(xué)誘導(dǎo)成年斑馬魚DI結(jié)腸炎的方法。在急性期，炎癥伴隨著神經(jīng)元含量的不平衡，與在IBD患者和實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物模型中觀察到的神經(jīng)元變化相當(dāng)。除了其多功能特性和可用的遺傳工具外，這種斑馬魚模型成為揭示IBD病理學(xué)機(jī)制和測(cè)試新IBD療法資源。

文丨Leen Uyttebroek,Casper Pype, Guy Hubens, Jean-Pierre Timmermans, Luc van Nassauw

翻譯丨彭逸

DOI丨European Journal of Histochemistry 2020; 64:3161