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核心摘要

使用斑馬魚作為實驗?zāi)Ｐ鸵鹆巳藗兊呐d趣，尤其是開發(fā)益生元和益生菌作為免疫和微生物組調(diào)節(jié)劑。盡管大多數(shù)益生元和益生菌都能確保對宿主有益，但對其影響的仔細評估仍然很重要，如人類益生菌的影響所顯示的發(fā)現(xiàn)有問題的研究設(shè)計、報告不完整、缺乏透明度或安全性報告不足等。

在這篇綜述中，我們描述了斑馬魚腸道的解剖結(jié)構(gòu)和功能，然后，我們總結(jié)并批判性地回顧了近來關(guān)于益生元和益生菌與斑馬魚微生物群和免疫反應(yīng)改變相關(guān)的大部分研究。

一、引言

1960 年代后期，匈牙利分子生物學家 George Streisinger 獲得斑馬魚，以研究在脊椎動物模型中應(yīng)用正向遺傳學的分子機制。

起初，研究人員使用斑馬魚研究發(fā)育生物學，隨后將斑馬魚應(yīng)用于許多其他領(lǐng)域。其中，由于斑馬魚基因組中人類直系同源基因的高度存在(約87%)及其內(nèi)在特征，斑馬魚作為研究免疫的模型脫穎而出。

與小鼠相比，斑馬魚體型?。?lt;5 cm）、高產(chǎn)（每周200-300個新后代）且生長速度快。斑馬魚在子宮外發(fā)育，結(jié)合胚胎的透明度，可以研究個體發(fā)育體內(nèi)從開發(fā)的早期時間點開始。

此外，使用轉(zhuǎn)基因魚有助于在體內(nèi)顯示特定的免疫細胞群，如中性粒細胞，這是基于中性粒細胞相關(guān)酶的熒光表達。它們注釋良好的基因組簡化了突變斑馬魚系的產(chǎn)生，其中一些有助于闡明免疫基因功能。

在過去十年中，基于Zinc finger nuclease、TALENs和非常成功的CRISPR-Cas的基因組編輯技術(shù)改變了在這種模式生物中可以解決單基因功能的速度。目前基因插入似乎仍然比基因敲除更具挑戰(zhàn)性，這在不久的將來無疑會發(fā)生變化。斑馬魚的特征與這些*的研究工具相結(jié)合，將這些斑馬魚確立為研究免疫過程和潛在分子機制的重要動物模型。

二、斑馬魚腸道：結(jié)構(gòu)、功能和微生物群

斑馬魚沒有胃，它們的消化道在解剖學上分為不同的部分：口腔、食道、三個腸段（前、中和后）。斑馬魚的食道與前腸段相連，其中，營養(yǎng)吸收主要是由于消化酶的含量高。營養(yǎng)吸收從前腸段到后腸段逐漸減少。離子轉(zhuǎn)運、水重吸收、發(fā)酵過程以及某些免疫功能發(fā)生在腸中段和后段。

通過研究成年斑馬魚腸道的基因表達，并將其與小鼠的腸道進行比較發(fā)現(xiàn)，所有脊椎動物IEC中都存在的一組核心基因，以及轉(zhuǎn)錄起始位點和調(diào)控區(qū)域的保守性，與序列相似性無關(guān)。

除了上述所有相似之處，斑馬魚和小鼠消化道之間存在明顯的解剖學差異。斑馬魚沒有胃、腸隱窩、pp淋巴結(jié)和Paneth cells。此外，飲食習慣、環(huán)境條件、體型和或特定代謝要求也存在差異。

早期的定植研究表明，每個微生物的遷入和腸道適應(yīng)都具有時間特異性：γ-變形菌在環(huán)境樣本和斑馬魚幼魚的腸道中含量很高，而β-變形菌在環(huán)境樣品中含量高。樣本和幼年斑馬魚的腸道，表明在初次接觸后某些種類的β-變形菌延遲定植。

斑馬魚幼體具有功能*的器官，但其免疫系統(tǒng)尚未*成熟。斑馬魚的適應(yīng)性免疫成熟是科學領(lǐng)域內(nèi)一個活躍的研究課題。在一項相對較小的研究中，我們發(fā)現(xiàn)T細胞控制斑馬魚腸道中變形菌的豐度，這提供了證據(jù)，證明與小鼠一樣，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在塑造微生物群組成方面發(fā)揮作用。如使用CD4-1:mCherry轉(zhuǎn)基因斑馬魚和CD8a+抗體染色所示，T細胞以4 dpf存在于胸腺中。結(jié)果表明，T細胞早在10 dpf就從胸腺中排出。這表明從那個時間點開始，斑馬魚可能會產(chǎn)生系統(tǒng)性適應(yīng)性反應(yīng)。

在起初的定植期之后，對于宿主和微生物的發(fā)育都很重要，微生物群被認為進入穩(wěn)定狀態(tài)。野生捕獲的斑馬魚和在兩個獨立實驗室設(shè)施中飼養(yǎng)的斑馬魚的腸道微生物群的比較表明，存在一個共享的所謂核心腸道微生物群。高質(zhì)量的16S rRNA基因分析顯示常見和豐富的細菌群由21個操作分類單位(OTU)代表，主要是變形桿菌門（氣單胞菌屬和希瓦氏菌屬），其次是梭桿菌或厚壁菌門（桿菌類）、放線菌門和擬桿菌門。

總之，地球上的所有生物都被其環(huán)境中的細菌物種定殖。宿主和定植微生物進行適應(yīng)以確保宿主和微生物群的健康。斑馬魚可以飼養(yǎng)GF并且在10 dpf時仍然是光學透明的，加上免疫細胞群轉(zhuǎn)基因的可能性，這一事實使斑馬魚成為研究微生物定植和免疫系統(tǒng)成熟時間的非常*的生物。

三、益生元

益生元可定義為不可消化的成分，通過選擇性刺激共生腸道細菌的生長或活性，從而改善宿主健康，對宿主產(chǎn)生有益影響。

益生元通常由小碳水化合物鏈組成，這些小碳水化合物鏈可作為葡萄糖（如β-葡聚糖）、半乳糖、果糖或甘露糖的低聚糖在市場上買到。我們總結(jié)了這些研究表格1，大多數(shù)研究是在胚胎斑馬魚中進行的，只有很少的研究是在成年斑馬魚中進行的。

斑馬魚研究中常用的益生元是褐藻糖膠（主要存在于褐藻和褐海藻中的硫酸化多糖）、β-葡聚糖（從細菌和真菌的細胞壁中提取的β-D-葡萄糖多糖），有時還有其他的，例如低聚半乳糖。值得注意的是，關(guān)于益生元對微生物群的調(diào)節(jié)知之甚少，因為大多數(shù)審查的研究僅調(diào)查了它們的免疫刺激作用。

表格1 在斑馬魚中進行的關(guān)于免疫和微生物群的益生元、益生菌和合生元研究總結(jié)

從幾種褐藻中提取的褐藻糖膠；將Eklonia cava ( 64 )、Chnoospora minima和Turbinaria ornata施用于水中的斑馬魚幼魚。在所有三項研究中，暴露于巖藻多糖的幼魚在LPS攻擊后表現(xiàn)出活性氧(ROS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)水平降低和整個幼魚細胞活力提高。

然而，在這些研究中，當胚胎在受精后8 hpf時，候選益生元在水中被稀釋。由于斑馬魚胚胎的在3 dpf才開口，完整的消化道要到6 dpf，此類研究并未證明益生元對腸道免疫有影響。優(yōu)選地，具有*發(fā)育的消化道（6 dpf或以上）的斑馬魚幼魚被用于研究這種相互作用。

此外，在斑馬魚幼魚中測試益生元可能會發(fā)現(xiàn)益生元功能，但總體目標通常是制定含有很好的益生元濃度的新型飲食。因此，幼魚或成年斑馬魚更合適。我們研究了來自褐藻Cladosiphon okamuranus的巖藻依聚糖對整個斑馬魚幼魚（水暴露）和成年斑馬魚腸道（用薄片喂養(yǎng)）中微生物群組成的影響。在成年斑馬的腸道中，il-1β的基因表達減少，顯性大腸桿菌（變形桿菌）減少，支持根瘤菌科和伯克霍德菌科，而在幼魚il-1β、il-10、tnfb和mmp9增加，但沒有觀察到微生物變化。

與巖藻多糖不同，β-葡聚糖可以作為斑馬魚的免疫刺激劑。來自燕麥的β-葡聚糖，在5 dpf的全胚胎斑馬魚中以劑量依賴性方式上調(diào)了tnfa、il-1β、il-10、il-12、defb1、lyz和c-rel 的基因表達。在一項類似研究中，從4 hpf到6 dpf的β-葡聚糖暴露上調(diào)了tnfa、mpo、tlf和lyz基因表達。在這兩項研究中，水中β-葡聚糖的給藥阻礙了魚對其攝取的量化，而且非常年輕的胚胎斑馬魚的暴露可能不會導致與腸道相關(guān)的影響。低聚糖如低聚半乳糖(GOS)和低聚果糖(FOS)經(jīng)常被用作農(nóng)業(yè)和人類嬰兒營養(yǎng)中的益生元，通過增加建議的有益細菌發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量來促進健康。以0.5%、1%和2%的包含水平喂食GOS 8周的成年斑馬魚顯示出tnfa和lyz表達的上調(diào)以及整個斑馬魚中總免疫球蛋白的增加。然而，沒有評估腸道特異性讀數(shù)。

很明顯，益生元可以根據(jù)其來源以特定方式作用于免疫系統(tǒng)。巖藻多糖可以減少炎癥標志物，而β-葡聚糖和GOS會增加促炎細胞因子的基因表達。盡管取得了有希望的結(jié)果，但絕大多數(shù)研究將未發(fā)育的胚胎斑馬魚暴露于無法通過自由喂養(yǎng)攝取添加劑的益生元。如果將此類候選益生元包含在干顆粒中，并在飽食前稍稍給魚服用（確保魚吃掉所有顆粒），則可以更清晰地估計益生元腸道水平并評估對腸道微生物群和免疫的影響。

前面提到的益生元研究中尚未廣泛采用的幾種方法也可能適用于斑馬魚的益生元腸道健康研究。需要組織學和免疫組織化學染色來了解腸道組織中的免疫調(diào)節(jié)作用（即正常腸道結(jié)構(gòu)的破壞）。轉(zhuǎn)基因斑馬魚可能有助于使用熒光激活細胞分選和成像來闡明哪些免疫細胞亞群滲入腸道。此外，這些亞群的細胞分選與轉(zhuǎn)錄組學將描述益生元的真正作用。

四、益生菌

早在1907年，Elie Metchnikoff就將益生菌的使用與預(yù)期壽命的延長聯(lián)系起來。出于本綜述的目的，我們將益生菌定義為活的或滅活的微生物，例如細菌或酵母菌，當通過水給予它們時，可以為宿主帶來益處，例如提高抗病性或增強免疫反應(yīng)。

益生菌可以通過多種方式影響宿主的健康：分泌抑制微生物病原體生長的次級代謝物或直接刺激免疫反應(yīng)以下調(diào)腸道炎癥。在這里，我們重點研究了斑馬魚中有關(guān)（腸道）免疫和微生物群調(diào)節(jié)的益生菌研究（總結(jié)于表格1）。

為了評估活益生菌的潛在健康益處，了解它們在宿主體內(nèi)的很好的環(huán)境（氧氣水平、pH值等）及其定植途徑非常重要。益生菌-宿主相互作用通過GF斑馬魚口腔-腸道病原體定植模型解決。

將6 dpf斑馬魚浸泡在25種潛在的腸道魚類病原體中，然后在3天內(nèi)記錄死亡率。Edwardsiella ictaluri引起的幼魚死亡率高，并被進一步選擇來挑戰(zhàn)這種魚。

然后，幼魚在E. ictaluri攻擊之前用37種可能的益生菌的單一菌株進行預(yù)定殖。通過這種廣泛的篩選，副溶血性弧菌、大腸桿菌ED1a-sm和E.coli MG1655 F'顯著提高了E. ictaluri感染后的存活率。V. parahaemolyticus通過抑制E. ictaluri的生長來保護宿主，而大腸桿菌則通過特定的粘附因子來保護宿主，例如F pili參與生物膜和結(jié)合形成，為宿主中的其他益生菌提供生態(tài)位。

值得注意的是，斑馬魚的鰓雖然在受精后2周內(nèi)活躍于氣體交換中，但卻為病原體提供了一個潛在的入口。有趣的是，在同一項研究中，副溶血性弧菌被評估為可能的益生菌，而魚腸弧菌被認為是可能的病原體。大多數(shù)微生物群研究將免疫反應(yīng)與分類學水平相關(guān)聯(lián)，例如屬或科（即弧菌屬），而不是物種或菌株。因此，將整個屬推廣到可能是物種甚至菌株特異性的功能。這種廣泛使用的概括可能來自難以生成足夠長的擴增子以區(qū)分密切相關(guān)的生物體。

此外，轉(zhuǎn)錄組學和散彈槍方法優(yōu)于16S rRNA基因分析來描述活躍的微生物群，因為它們提供更多關(guān)于魚類健康狀況的信息。成年斑馬魚也被用來測試益生菌作為人類益生菌消耗的模型。

將成年斑馬魚暴露于兩種大腸桿菌菌株（Nissle和MG 1655 ΔptsG），并用霍亂弧菌（El Tor 菌株）進行攻擊。大腸桿菌屬減少水箱水中的粘蛋白含量，這是腹瀉的指標，盡管這些粘蛋白也可能是由于皮膚脫落造成的。評估這些大腸桿菌是否存在可能會很有趣。如前所述，通過減少Myd88-Notch信號來增加分泌細胞的發(fā)育，從而增加粘液分泌。

此外，雖然在人類中通過口服溶液給予細菌是確保攝入的有效方法，但向水中添加益生菌可能無法保證被魚吸收，并可能影響整個魚的粘膜（皮膚、鰓、腸道），不僅被腸道吸收。魚腸道的環(huán)境比人類腸道環(huán)境更需氧，在這些需氧條件下，乳酸菌可能會被其他細菌擊敗。這個基本原理可以解釋為什么通過浸泡在斑馬魚中測試的人類益生菌（乳酸桿菌屬）不能提供對E. ictaluri感染的保護。

幾項研究報告稱，乳酸菌(LAB)是良好的益生菌候選物，因為它們能夠耐受和粘附在腸道上，產(chǎn)生的乳酸可抑制病原菌的生長，并加強粘膜屏障。在用嗜水氣單胞菌進行浸泡挑戰(zhàn)后，與對照相比，從3-25 dpf浸入干酪乳桿菌BL23的斑馬魚顯示出更高的存活率。與對照相比，在嗜水空氣單胞菌攻擊后8和24小時后，il-1β、C3a和il-10的腸道基因表達上調(diào)。

有趣的是，來自該屬的潛在益生菌乳酸桿菌以菌株特異性方式調(diào)節(jié)基因調(diào)控。事實上，與對照相比，浸入發(fā)酵乳桿菌NA4的GF幼魚在化學誘導的炎癥后顯示出增加的il-10表達和減少的il-1β和tnfa表達。

然而，在同一項研究中，斑馬魚幼魚浸泡在幾種植物乳桿菌菌株（WCFS1和NA7）或其他發(fā)酵乳桿菌菌株（ATCC9338和NA6）中并沒有表現(xiàn)出這些基因表達差異。上述研究中基因表達的差可能是由于魚齡、組織分析（腸道與整個幼魚）所應(yīng)用的挑戰(zhàn)（活病原體與化學物質(zhì)）以及用作益生菌候選物的特定乳桿菌菌株。

淀粉芽孢桿菌在商業(yè)飲食中每天補充兩次，持續(xù)30天，上調(diào)il-1β、il-6、il-21tnfa、溶菌酶、tlr1、tlr3。盡管沒有考慮其他免疫參數(shù)，但基因表達的上調(diào)似乎與增強的先天免疫有關(guān)。

在另一項針對成年斑馬魚的研究中，商業(yè)飲食補充了多種凍干益生菌菌株30天。益生菌混合物上調(diào)了腸道中il-1β、tnfa、myd88、il-10、casp1、nos2a、tgfb1a、nfkb、tlr1、tlr2、tlr3和tlr9的表達。

此外，益生菌混合物增加了所有上調(diào)基因（Tlr2蛋白除外）編碼的蛋白質(zhì)水平。一方面，益生菌混合物中的某些細菌可能抑制了Tlr2，這反過來又可能部分抑制了myd88。另一方面，益生菌混合物中的其他細菌可能增強了其他TLR的表達，這些TLR上調(diào)了myd88和整體Myd88平衡協(xié)調(diào)的先天免疫反應(yīng)。

如前所述，微生物物種可以影響宿主免疫力，而不管它們的豐度如何，并且當混合使用益生菌時，每個物種的影響更難解開。其他使用LAB作為益生菌的研究不僅檢測了基因表達，還檢測了斑馬魚腸道中的微生物群和組織學變化。

一些研究調(diào)查了酵母作為斑馬魚益生菌的潛力。GF和CONV斑馬魚幼魚從2-3 dpf浸入兩種酵母的溶液中，然后在14 dpf時對腸道微生物群進行采樣。盡管觀察到微生物變化，但未測量免疫相關(guān)結(jié)果，因此本研究中酵母菌的益生菌作用仍未確定。

在另一項研究中，4 dpf斑馬魚在受到攻擊前暴露于15種熒光標記的酵母菌株2小時。大多數(shù)酵母菌株在攻擊后具有增加的存活率。在后來的實驗中，同一組使用類似的設(shè)置進一步研究了GF和CONV幼魚中的兩種酵母菌株。在攻擊后，暴露于任一酵母菌株顯著增加了GF和CONV幼魚的存活率。被攻擊的CONV斑馬魚表現(xiàn)出il-1β、c3、tnfa、mpx和il-10表達的上調(diào)。用任一酵母菌株進行預(yù)處理可阻止CONV和GF幼魚中的此類基因上調(diào)，表明這些酵母菌株可能會阻止或降低攻擊的影響。

斑馬魚也被用于合生元研究，這些研究通常結(jié)合使用益生元和益生菌。干酪乳桿菌BL23和胞外多糖復合物(ESPS)在3至12 dpf的GF和CONV幼魚中進行了組合研究。干酪乳桿菌暴露于維羅單胞菌攻擊24小時后上調(diào)tnfa、il-1β、il-10和saa表達，并在攻擊48小時后下調(diào)這些基因的表達。

值得注意的是，在24小時攻擊后，單獨的ESPS上調(diào)tlr1、tlr2、il-10和tnfa并下調(diào)il-1β。合生元，干酪乳桿菌BL23和EPSP在A. veronii攻擊后劑量依賴性地提高存活率。將具有增強生物活性的E. cava酶消化物作為益生元與作為益生菌的植物乳桿菌在成年斑馬魚中聯(lián)合補充21天，可降低腸道中iNOS和環(huán)氧合酶2 ( cox2 )的水平。此外，當益生元和益生菌一起給藥時，與單獨用植物乳桿菌處理的魚相比，它們在用遲發(fā)性大腸桿菌攻擊后增加了存活率。有趣的是，這些研究表明某些提取物或生物活性化合物而不是整個益生元可能會引起免疫調(diào)節(jié)。

大量研究將潛在的益生元和益生菌暴露于斑馬魚，以通過微生物調(diào)節(jié)來改善它們的免疫狀況（圖1）。

圖1  斑馬魚腸道中益生元和益生菌、免疫系統(tǒng)和微生物群相互作用的概述

值得注意的是，在大多數(shù)這些研究中，基因表達被認為是決定性的免疫讀數(shù)。除了基因表達并不總是轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)功能這一事實外，促炎和抗炎細胞因子通常根據(jù)反應(yīng)的動力學和時間而上調(diào)或下調(diào)?；虮磉_可能反映免疫反應(yīng)期間宿主的平衡：特異性和強度足以對抗?jié)撛诘闹虏〖毦瑫r能夠耐受共生宿主微生物群。這種平衡還取決于不同的細胞類型，它們協(xié)同工作以防止在對抗入侵病原體或持續(xù)炎癥時對宿主造成過度損害。

我們需要更詳細地了解參與不同反應(yīng)的不同免疫細胞類型的作用和存在，然后才能嘗試調(diào)節(jié)對宿主有益的反應(yīng)。為此，斑馬魚仍然是理想的候選模式生物。迄今為止，更多的研究可以利用斑馬魚的*工具，例如不同轉(zhuǎn)基因報告斑馬魚（細胞因子以及免疫細胞群）的實時成像，以更廣泛地了解宿主-微生物的復雜動態(tài)相互作用相互作用。

五、結(jié)論

近來，使用小鼠模型進行的新研究表明，微生物群落可以影響病毒感染的嚴重程度。此外，使用RAW264.7細胞的體外數(shù)據(jù)顯示，幾種乳桿菌菌株通過IFN-β上調(diào)對鼠諾如病毒(MNV)感染具有抗病毒活性。目前，尚不清楚微生物是否也能改變魚類*的病毒感染性。這是一個令人興奮的新研究途徑，可能會導致新的疫苗接種策略，將靶向病毒的疫苗與益生元或益生菌治療相結(jié)合，以改變微生物群并靶向病毒本身。由于其*的優(yōu)勢，斑馬魚有可能成為其中的一個基本領(lǐng)域。

使用斑馬魚在該領(lǐng)域發(fā)表的研究將繼續(xù)增加，并結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)（組學、免疫組織化學、FACS、體內(nèi)成像）或通過新興的新技術(shù)知識空白肯定會被填補。對于未來的實驗，如果采用更全面的方法，將大大有助于我們的理解。我們需要在每個實驗中結(jié)合讀取參數(shù)，例如基因表達、攻擊后存活率、腸道結(jié)構(gòu)、免疫細胞募集、微生物群組成、代謝物產(chǎn)生和行為數(shù)據(jù)，以提供某些治療對健康的后果的更廣泛的了解。只有通過基因編輯詢問可能的分子途徑來仔細確定因果關(guān)系，我們才能為新型免疫調(diào)節(jié)策略的設(shè)計提供堅實的理論基礎(chǔ)。

文丨Adrià López Nadal ,Wakako Ikeda-Ohtsubo, Detmer Sipkema, David Peggs ,Charles McGurk, Maria Forlenza，Geert F. Wiegertjes and Sylvia Brugman     

翻譯丨周佳麗

DOI丨Frontiers in Immunology，F(xiàn)ebruary 2020 | Volume 11 | Article 114