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核心摘要
肢端肥大癥是一種由生長激素(GH)分泌過多引起的病理疾病，主要由垂體腺瘤產(chǎn)生。長時(shí)間暴露過量的生長激素會(huì)導(dǎo)致廣泛的系統(tǒng)表現(xiàn)和共病，研究過量生長激素對(duì)細(xì)胞水平的影響可以幫助了解肢端肥大癥健康并發(fā)癥和共病的潛在原因。在之前的研究中，已經(jīng)證明，在肢端肥大斑馬魚模型中，過量的GH減少了體側(cè)種群(SP)干細(xì)胞，并誘導(dǎo)了過早衰老的跡象。
在本次研究中，我們?cè)诨虮磉_(dá)水平上更深入地研究肢端肥大癥的衰老及肢端肥大癥是否在不同器官誘導(dǎo)衰老遺傳特征。在肢端肥大癥和老年斑馬魚的不同器官中，我們發(fā)現(xiàn)了重疊的差異表達(dá)基因（DEG）。大約一半的肌肉、肝臟和大腦的肢端肥大癥基因與老年斑馬魚的DEG重疊，我們確定了重疊DEG的生物學(xué)功能。富集數(shù)據(jù)庫分析和基因本體研究表明，大多數(shù)重疊的肌肉基因參與衰老代謝，而重疊的肝臟基因參與代謝途徑、缺氧反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因此，本研究在基因表達(dá)水平上提供了肢端肥大癥的*老化遺傳特征。

一、引言
丙激素肥大是一種由過量生長激素(GH)水平以及隨后的胰島素樣生長因子1（IGF-1）引起。乙囊腫大通常由垂體腺瘤引起。在較少的病例中，該疾病可能是由異位生長激素分泌或垂體增生引起的。巨人癥和肢端肥大癥都是由過量的GH和IGF-1分泌物引起的罕見疾??；然而，巨人癥發(fā)生在青春期前生長激素過量觸發(fā)線性發(fā)育時(shí)，而肢端肥大癥發(fā)生在附生印章關(guān)閉后。
過度暴露于生長激素會(huì)導(dǎo)致身體毀容，包括寬闊的雙臂、腿部、增厚的軟組織、臉變大、鼻子和前額突出。漸進(jìn)性肢端肥大癥的特征是骨骼缺陷導(dǎo)致背后凸和胸腔變形。
除了異常的軟組織生長和肥大外，肢端肥大癥患者還出現(xiàn)了許多系統(tǒng)性表現(xiàn)和共病，包括胃腸道疾病、生殖疾病、關(guān)節(jié)炎、腕管綜合征、虛弱無力、結(jié)腸息肉和心血管疾病。
在過去的二十年里，我們對(duì)巨人癥和肢端肥大癥的遺傳病因?qū)W有了更好地了解。幾種新的基因突變會(huì)破壞它們細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)生長激素素分泌過多的生長營養(yǎng)途徑，包括芳烴受體相互作用蛋白(AIP)基因種系突變和X連鎖生長激素綜合征(XLAG)性狀。

圖1所示，肌肥大肌肉在基因表達(dá)水平上老化。(a)肢端肥大癥腎、肌肉、肝臟和大腦中基因特征基因老化的GSEA結(jié)果。小于0.05的顯著p值和小于0.25的FDRq值以紅色表示。(b)層次簇分析來自WT肌肉、肝臟和大腦、肢端肥大癥模型（1歲）和老年斑馬魚（3歲）的樹狀圖和RNA序列數(shù)據(jù)熱圖。
肢端肥大癥的全身表現(xiàn)廣泛遍布全身，表明過量生長激素的病理作用作用于細(xì)胞水平。發(fā)現(xiàn)肢端肥大癥的潛在遺傳原因是至關(guān)重要的開發(fā)新的診斷和治療方法。然而，較少的研究集中在過量生長激素的病理影響，以及生長激素如何在細(xì)胞水平上起作用，導(dǎo)致肢端肥大癥合并癥。
在之前的研究中，我們開發(fā)了一個(gè)過度分泌的肢角肥大斑馬魚模型，以研究過量GH對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的病理影響。在肢端肥大癥的體細(xì)胞和干細(xì)胞中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多被破壞的參數(shù)，如DNA損傷的增加和DNA修復(fù)途徑的受損。在我們的肢端肥大癥模型中，由于生長激素過多而引起的主要疾病包括體內(nèi)側(cè)種群(SP)干細(xì)胞數(shù)量的逐漸減少和干細(xì)胞氧化應(yīng)激的增加。此外，我們還觀察到了過早衰老的跡象。
因此，在這里，我們通過研究肢端肥大癥是否在不同器官中表現(xiàn)出豐富的衰老基因特征來研究在基因表達(dá)水平上更深入的衰老。此外，我們研究了肢端肥大癥和衰老差異表達(dá)基因(DEGs)之間是否存在重疊，并確定了肢端肥大癥和衰老之間共同的生物學(xué)主題。
二、結(jié)果
2.1 基因表達(dá)水平老化
在我們之前的研究中，羅非魚過表達(dá)斑馬魚肢端肥大模型，以研究過量生長激素對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的病理影響。我們已經(jīng)在細(xì)胞確定了細(xì)胞水平上許多被破壞的信號(hào)途徑和生物過程。主要的發(fā)現(xiàn)是在我們的模型中干細(xì)胞數(shù)量的下降和衰老的過早跡象。
為了研究肢端肥大癥在基因表達(dá)水平上的衰老，我們使用了基因年齡數(shù)據(jù)庫，以確定不同器官衰老的共同遺傳特征。我們使用了之前發(fā)表的從野生型肝臟、肌肉、腎臟和大腦(WT)（1歲）、肢端肥大癥（1歲）和老年斑馬魚（3歲）提取的mRNARNA序列數(shù)據(jù)（基因表達(dá)綜合(GEO)加入號(hào)RNAsEq數(shù)據(jù)。gse113169)。使用來自肝、肌肉、腎臟和大腦的肢端肥大癥RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析(GSEA)，以檢測(cè)相應(yīng)器官中基因基因特征基因的富集。
如圖1a中可見，所有肢端肥大器官的老化遺傳數(shù)據(jù)集的富集分?jǐn)?shù)呈正，表明各器官基因基因集的上調(diào)；然而，富集僅在肢端肥大肌肌肉中顯著（p<0.01和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)q值=0.08）。
為了證實(shí)這些結(jié)果，我們用不同的方法研究了基因表達(dá)水平上的肢端肥大癥衰老。我們從野生型WT品系的肌肉、肝臟和大腦、肢端肥大模型（1歲）和老年斑馬魚（3歲）生成了RNAseq數(shù)據(jù)的分層樹狀圖（圖1b）。重要的是，層次聚類產(chǎn)生了相同的結(jié)果，并在肢端肥大癥和老年斑馬魚的基因表達(dá)模式上僅在肌肉中，但在肝臟或大腦中沒有相似性(圖1b)。

圖2. 肢端肥大癥和老年肌肉基因與WT肌肉圖。Y軸，−log10（p值）；X軸，log2（折疊變化）。橙色的基因被認(rèn)為是顯著的（n=3）。
2.2 肢端肥大癥和老年斑馬魚基因表達(dá)差異
p值之間的過度表達(dá)基因用于識(shí)別不同器官中肢端肥大（1歲)和年齡斑馬魚(3歲）的DEG(=Adj p<0.05)。
圖2顯示了肢端肥大癥和老年肌肉、肝臟和大腦的RNAseq基因的火山圖。
由于我們的肢端肥大癥模型顯示出過早衰老的跡象和與老年肌肉相似的基因表達(dá)模式，我們研究了肢端肥大癥的DEGs是否與老年斑馬魚的DEGs重疊。我們建立了肢端肥大癥和老年肌肉、肝臟和大腦的上下凹陷的維恩圖。

圖3. 乙度重疊 (a)肢端肥大癥和老年斑馬魚肌肉、大腦和肝臟上下圖的靜脈圖。(b)柱形圖，顯示上下肢端肥大癥密度與老年斑馬魚重疊的百分比
雖然老年斑馬魚的DEG數(shù)量較高，但大多數(shù)肢端肥大癥DEG與老年DEG重疊（圖2和3a）。值得注意的是，也以同樣的方式觀察到重疊；肢端肥大癥向上的凹陷與老化的凹陷重疊，而不是向下的凹陷，反之亦然（圖3a）。
超過50%的肢端肥大癥下降指數(shù)與肌肉中的老年指數(shù)重疊，而約40%的上升指數(shù)與老年指數(shù)重疊（圖3b）。重要的是，肢端肥大下降和老年下降之間或肢端肥大上升和肌肉老年下降之間幾乎沒有重疊（圖3a）。這些結(jié)果支持了我們之前的觀察結(jié)果，即肢端肥大肌在基因表達(dá)模式上與老年斑馬魚相似。
雖然層次聚類和GSEA結(jié)果（圖1）并沒有顯示肢端肥大癥大腦的老化，但Venn圖顯示，65%的肢端肥大癥下降的DEGs與大腦中老化的DEGs重疊。約40%以上密度在老年中重疊（圖3）。有趣的是，在肝臟中也觀察到同樣的結(jié)果（圖3）。
2.3 豐富了生物主題和肌肉中重疊凹陷的信號(hào)途徑
      因此，我們對(duì)重疊的DEGs進(jìn)行了富集分析，以確定肢端肥大癥和衰老之間的共同信號(hào)途徑和生物過程。肢端肥大癥與老年肌肉之間重疊DEG的基因本體(GO)分析顯示，生物過程中代謝途徑如乙醇、氧酸和類固醇代謝的富集（圖4a），以及分子功能酶活性的富集（圖4a）。我們使用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)豐富酶活性的作用進(jìn)行了分類。分析表明，大部分富集酶活性與代謝過程有關(guān)，而細(xì)胞成分分析顯示球蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的富集（圖4a）。

圖4 豐富的肌肉重疊障礙的途徑分析。(a)圍棋分析顯示了豐富的生物過程、分子功能和細(xì)胞成分。(b)來自反應(yīng)組、KEGG和生物行星數(shù)據(jù)庫中的肌肉重疊DEGs的豐富信號(hào)通路的直方圖。y軸，富集的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；x軸，途徑類別。與代謝相關(guān)的途徑和GO類別用星號(hào)表示。BDNF，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；PPAR，過氧化物酶體增殖體激活受體。
有趣的是，通路分析表明，大多數(shù)富集的信號(hào)通路也與代謝有關(guān)（圖4b）。反應(yīng)組數(shù)據(jù)庫分析揭示了脂質(zhì)、磷脂、脂肪酸和甘油三酯的代謝途徑的富集，而KEGG和生物行星數(shù)據(jù)庫分析顯示脂肪酸、糖酵解、氮和各種氨基酸代謝途徑。
為了研究參與肌肉老化代謝的重疊基因的百分比，我們將代謝相關(guān)基因量化為重疊基因的總數(shù)。我們發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)與代謝相關(guān)的重疊DEGs都被下調(diào)了。大約50%的向下重疊DEG和20%的向上重疊DEG與代謝相關(guān)（圖5）。

圖5 顯示與肌肉代謝過程相關(guān)的上下重疊密度的百分比的餅圖
2.4 豐富的肝臟重疊病的生物主題和信號(hào)途徑
維恩圖顯示，約40%的肢端肥大癥肝臟DEGs與老年DEGs重疊（圖3）。因此，我們研究了這些重疊基因的生物學(xué)功能。
對(duì)肝臟中重疊DEG的分析顯示，三類主要富集：代謝途徑、缺氧反應(yīng)和E室應(yīng)激。對(duì)缺氧的反應(yīng)、脂肪酸代謝過程、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白激酶R(PKR)樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)介導(dǎo)的未展開蛋白反應(yīng)和ER都是豐富的生物主題（圖6a）。

圖6 富集轉(zhuǎn)移和肝臟重疊病的途徑分析。(a)GO分析顯示肝臟重疊DEG的豐富的生物過程、分子功能和細(xì)胞成分。(b)來自反應(yīng)組、愛思唯爾通路、維基通路、NCI自然和生物行星數(shù)據(jù)庫的肝臟重疊病的豐富信號(hào)通路的直方圖。y軸，富集的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；x軸，途徑類別。與缺氧相關(guān)的途徑和GO類別用星號(hào)表示。HIF-1，缺氧誘導(dǎo)因子；miR33，微RNA標(biāo)識(shí)符；SREBF，甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白基因
同樣，分析顯示，與缺氧和代謝相關(guān)的途徑豐富（圖6b）。重要的是，GSEA對(duì)肢端肥大癥（1歲）和老年斑馬魚（3歲）的肝臟缺氧的反應(yīng)顯著下降（圖7a）。

圖7 重疊的肝臟DEGs中的缺氧、代謝和應(yīng)激相關(guān)基因。(a)細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的GSEA結(jié)果的說明。顯著的p<0.05和FDRq值<0.25都是用紅色書寫的。報(bào)告的p值為0.0，表示實(shí)際的p值小于0.01（n=3）。(b)顯示與肝臟代謝、缺氧和急診室應(yīng)激相關(guān)的重疊密度百分比的餅圖。
因此，我們將與代謝、缺氧反應(yīng)和急診室應(yīng)激相關(guān)的重疊基因量化為肝臟中重疊基因的總數(shù)。我們發(fā)現(xiàn)肝臟中大多數(shù)重疊基因與這三類相關(guān)（圖7b）。
2.5  豐富的生物主題和大腦中重疊障礙的信號(hào)途徑
與肌肉和肝臟相似，維恩圖顯示，大多數(shù)肢端肥大癥腦DEGs與重疊老化的大腦。如圖3所示，大約65%的肢端肥大癥下降與大腦中的下降障礙重疊。
對(duì)大腦中重疊DEG的分析表明，轉(zhuǎn)錄、DNA結(jié)合、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白結(jié)合和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的積極調(diào)節(jié)豐富了生物學(xué)過程和分子功能。細(xì)胞成分富集肌鈣蛋白、肌鈣蛋白和皺膜的細(xì)胞突出（圖8a）。

圖8 豐富的圍棋和大腦重疊障礙的途徑分析 (a)圍棋分析顯示豐富的生物過程、分子功能和大腦重疊的細(xì)胞成分；(b)來自反應(yīng)組、KEGG和生物行星數(shù)據(jù)庫的大腦重疊DEGs的豐富信號(hào)通路的直方圖。y軸，富集的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；x軸，途徑類別。cGMP-PKG、環(huán)鳥苷一磷酸依賴蛋白激酶或蛋白激酶G、epo、促紅細(xì)胞生成素、ERKs、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、FOS、Fos原癌基因、GM-CSF、粒端集落刺激因子、HTR1-5-羥色胺受體1、JNK、c-Junn-n-n端激酶、有絲分裂原活化蛋白激酶、NGF、神經(jīng)生長因子、NMDA、n-甲基-d-天冬氨酸、R-SMAD、受體調(diào)節(jié)SMAD、TRK、原肌球蛋白受體激酶。
反應(yīng)組、KEGG和生物行星數(shù)據(jù)庫的路徑分析顯示，豐富了發(fā)育生物學(xué)、間隙結(jié)、晝夜節(jié)律夾帶、長期增強(qiáng)和MAPK信號(hào)途徑（圖8b）。
2.6  生長激素培養(yǎng)的人類卵母細(xì)胞在基因表達(dá)水平上顯示出衰老
在肢端肥大斑馬魚模型中，過量的生長激素影響了衰老、干細(xì)胞數(shù)量和完整性。因此，研究過量的GH是否會(huì)對(duì)人類細(xì)胞有同樣的影響是很重要的。在這里，我們已經(jīng)嘗試著學(xué)習(xí)GEO（基因表達(dá)的綜合）。
我們使用GSEA分析來研究轉(zhuǎn)基因卵母細(xì)胞是否豐富了衰老特征。有趣的是，這個(gè)基因集和一個(gè)針對(duì)過早衰老疾病的數(shù)據(jù)集(沃納綜合征，MSigDBno。在GH培養(yǎng)的人卵母細(xì)胞中顯著升高（圖9）。

圖9 GH培養(yǎng)的人卵母細(xì)胞在基因表達(dá)水平上顯示出老化 (a)基于對(duì)微陣列數(shù)據(jù)的元分析，對(duì)隨年齡持續(xù)過表達(dá)的基因組集進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的GSEA結(jié)果的說明；(b)過早衰老障礙數(shù)據(jù)集（Werner綜合征，MSigDB號(hào)。M1996)。顯著的p<0.05和FDRq值<0.25都是用紅色書寫的。報(bào)告的p值為0.0，表示實(shí)際的p值小于0.01。
我們使用GSEA分析來研究轉(zhuǎn)基因卵母細(xì)胞是否豐富了衰老特征。有趣的是，這個(gè)基因集和一個(gè)針對(duì)過早衰老疾病的數(shù)據(jù)集(沃納綜合征，MSigDBno。在GH培養(yǎng)的人卵母細(xì)胞中顯著升高（圖9）。
三、討論
斑馬魚是研究人類遺傳疾病的一種很有前景的模式生物，因?yàn)樗型暾麥y(cè)序的基因組、易于遺傳操作、幼蟲透明、生命周期短和成本低。此外，斑馬魚在生理學(xué)上與哺乳動(dòng)物相似。
為了確定肢端肥大癥合并癥背后的分子機(jī)制，一種羅非魚-GH過表達(dá)的斑黃魚被開發(fā)為肢端肥大癥模型。我們已經(jīng)證明，過量的GH會(huì)影響到全身的細(xì)胞完整性。
此外，我們?cè)谥朔蚀蟀Y體細(xì)胞和干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了許多破壞的生物參數(shù)。有趣的是，我們的斑馬魚模型顯示了腎臟、肌肉和大腦中過早衰老和SP干細(xì)胞減少的跡象。這鼓勵(lì)了我們?cè)诨虮磉_(dá)水平上更深入地研究肢端肥大癥的衰老。

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