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文丨Lina Lebedeva,Beibitgul Zhumabayeva, Tatyana Gebauer, Ilya Kisselev and Zaure Aitasheva
翻譯丨馬雪梅
DOI: 10.1089/zeb.2020.1926
核心摘要
斑馬魚(Danio rerio)自20世紀(jì)50年代被引入科學(xué)研究后，已成為研究再生過程和機制的一個有價值的模型。斑馬魚表現(xiàn)出異形再生，即截肢后形成的未分化細胞團能夠*再生失去的組織，如四肢、心肌、大腦、視網(wǎng)膜和脊髓。斑馬魚的肢體再生過程包括幾個階段，其特征是特定信號通路的激活和基因表達。本文以斑馬魚為模型，對影響肢體再生的關(guān)鍵因素進行了綜述。

一、斑馬魚概述
斑馬魚是鯉科的一種小型熱帶魚類，生活在印度、孟加拉國、緬甸和尼泊爾的淡水河流和池塘中。斑馬魚作為一種模式生物在20世紀(jì)30年代初被引入科學(xué)。由于體外受精和能夠使大部分受損組織*再生，斑馬魚被廣泛用于揭示脊椎動物胚胎發(fā)育和再生的機制。
斑馬魚具有體積小、繁殖快、養(yǎng)殖方便、養(yǎng)殖成本低等特點，因此在生物和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的主要領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。1951年，在PubMed上發(fā)表了7篇與斑馬魚相關(guān)的論文，到2019年增加到3911篇。盡管斑馬魚不能取代哺乳動物家鼠、小家鼠、灰鼠、褐家鼠，但在再生過程的研究中，它已經(jīng)取代了爪蛙，發(fā)表了269篇文章，而2019年發(fā)表了29篇。
癌癥、肥胖、壓力、再生、糖尿病、心血管疾病和其他常見疾病可以通過使用斑馬魚進行研究。斑馬魚不僅是一種模式生物，而且還是一種實驗對象，被廣泛用于檢測化學(xué)制劑的毒性以及土壤和水的污染。斑馬魚的一個主要特征是它能夠*恢復(fù)受損的器官和組織，如鰭、心肌、視網(wǎng)膜和肌肉，使它們可以用于探索細胞內(nèi)機制，以實現(xiàn)假設(shè)和實際目的。
二、斑馬魚早期及當(dāng)前研究實踐
涉及組織再生的復(fù)雜過程和機制一直是生物學(xué)上一個重要的正在進行的課題。公元前8世紀(jì)，希臘詩人赫西奧德介紹了普羅米修斯，他的肝臟每天都被老鷹伊頓啄出，但第二天早上就*再生了。亞里士多德在他關(guān)于自然史的文章中提到，動物胚胎的再生效率比成人高。幾個世紀(jì)后的1744年，日內(nèi)瓦的一位博物學(xué)家和動物學(xué)家亞伯拉罕·特倫布利)出版了一本關(guān)于九頭蛇再生過程的書。通過連續(xù)切片，他證明了亞述德拉岡可以從身體的一小塊碎片再生。
直到20世紀(jì)，托馬斯·摩根描述了水螅和蠕蟲的觀察結(jié)果，并闡明了兩種類型的再生的基本原理:形態(tài)軸和形態(tài)上的。形態(tài)軸是息肉的常見表現(xiàn)形式，在息肉中，原有的細胞在受傷后立即重組，以重組身體失去的部分。魚類、兩棲動物和爬行動物的四肢再生是異形的，在這個過程中，未分化的細胞群遷移到受傷部位，形成胚基，并迅速增殖成被切除的器官。
后來的實驗檢測了干細胞在這一過程中的作用，并確定了再生的階段。分化和脫分化是調(diào)節(jié)組織和器官再生的兩個關(guān)鍵過程。開始在組織損傷或截肢后，多能干細胞被激活，損傷部位附近的分化體細胞轉(zhuǎn)化為單能干細胞并開始分裂。這些單能干細胞隨后去分化為體細胞，取代受損的結(jié)構(gòu)。
目前，科學(xué)家們和過去一樣，專注于識別哺乳動物(主要是人類)受損器官恢復(fù)正常功能的機制，這些動物具有較低的再生潛力。
人體器官按再生能力可分為高等再生的器官(血液和皮膚)；中等再生器官，有物理創(chuàng)傷后再生(骨，肝和骨骼肌)；和低等再生器官（神經(jīng)系統(tǒng)，心肌和肌肉）無法再生失去的細胞。由于缺乏再生潛力，第三類器官的任何退化過程都會導(dǎo)致嚴重殘疾或死亡。心臟病發(fā)作、截肢(盡管人類和老鼠的胎兒可以自發(fā)地再生趾尖)或神經(jīng)元退化的影響。盡管人們對其分子機制有所了解，但再生過程的調(diào)控機制仍不*清楚，但纖維化組織的形成是限制器官修復(fù)的關(guān)鍵因素。
傳統(tǒng)上認為，只有無脊椎動物和低等脊椎動物可以再生器官，而高等脊椎動物，除了爬行動物和兩棲動物，都沒有這種能力。墨西哥鈍口蠑螈、爪蛙和一些種類的蜥蜴，包括華麗的縫隙龍、Ctenophorus ornatus和特內(nèi)里費蜥蜴的幼崽，可再生尾巴、肢芽、眼晶體和神經(jīng)元。即使在表現(xiàn)出非凡再生潛力的生物體中，斑馬魚也表現(xiàn)出非凡的能力來修復(fù)失去的結(jié)構(gòu)，并顯示出作為心臟、視網(wǎng)膜、皮膚和大腦再生醫(yī)學(xué)研究模型的高潛力。
與大多數(shù)羊膜動物(包括鳥類和哺乳動物)不同的是，胚胎和成年斑馬魚的再生過程不需要用纖維組織替換受傷部位。沒有這一過程，器官就可以重新發(fā)育，心肌、眼睛、鰭和其他重要器官的功能也可以*恢復(fù)。
三、斑馬魚尾鰭再生
      哺乳動物與魚類不同，兩棲動物，如美西螈，在整個生命的后階段都不能再生四肢。盡管在無羊膜動物和羊膜動物中，負責(zé)肢體再生和誘導(dǎo)體細胞和干細胞去分化、增殖和分化的關(guān)鍵基因是相似的，但在哺乳動物中，這些基因在截肢后不被激活。
在無羊膜動物中，截肢部位通常被疤痕覆蓋，疤痕不能代替失去的肢體，也不能保護潛在的重要器官和正常功能的皮膚。與無羊膜動物相反，羊膜斑馬魚是研究異形再生的理想模型，在這個模型中，前體細胞活動、遷移、形成未分化的細胞團，增殖、分化，*恢復(fù)被切除器官的大小、形態(tài)和功能。多次截肢并不會降低斑馬魚的再生能力。
尾鰭之所以被許多研究人員選擇作為研究對象，是因為尾鰭的特性可以清楚地研究其再生過程。它是斑馬魚超大的魚鰭，便于操作和觀察。鰭生長的研究不需要試劑或設(shè)備。
尾鰭有兩個葉，可以是異尾的或同尾的，這這樣就可以不依賴于魚的身體，沿著魚的內(nèi)側(cè)軸監(jiān)測它的生長。與兩棲動物或哺乳動物的四肢相比，鰭的解剖結(jié)構(gòu)更簡單。再生過程在14-28天內(nèi)完成，取決于水質(zhì)、溫度、飼料、病原生物入侵和飼養(yǎng)密度。
斑馬魚的尾鰭與臀鰭、背鰭、胸鰭類似，屬于硬骨型，由成骨細胞和成纖維細胞組成。鰭的主要結(jié)構(gòu)組成部分是一個分節(jié)的、鈣化的圓柱形射線，遠端是中空的，產(chǎn)生并排列在內(nèi)外兩側(cè)的成骨細胞上，與結(jié)締組織相對，而結(jié)締組織構(gòu)成了大多數(shù)魚類的鰭的外層。所述鰭條在近端具有一個未分段的區(qū)域。每個鰭段(鱗翅目)由兩個被稱為半剛體的凹段組成，由柔性纖維連接。
鱗毛菌由成纖維細胞、血管、色素細胞和神經(jīng)元組成。它們被表皮覆蓋，并由關(guān)節(jié)連接。大多數(shù)近端節(jié)段由礦化基質(zhì)支撐，但形成每條射線遠端三到四個節(jié)段沒有骨基質(zhì)，而是由稱為放線菌的非鈣化針狀體支撐。
由于放線菌的主要成分彈性素中含有膠原和非膠原成分，鰭具有剛性和柔性。放線菌提供一層膜來支持骨基質(zhì)，形成運動器官。鱗屑毛的形成雖然落后于放線菌，但放線菌是成骨細胞遷移和分化的必要因素。由成纖維細胞產(chǎn)生的薄薄的皮膚褶皺覆蓋了所有的鰭條，允許它們收縮和釋放，從而減少或增加鰭的面積。
對運動至關(guān)重要的肌肉附著在半營養(yǎng)體的基部。斑馬魚的尾鰭由16-18條鰩組成。裂外側(cè)線和內(nèi)側(cè)線的區(qū)別大約有四段。在魚的整個生長過程中，光線通過在遠端增加新的節(jié)來生長(如下圖1)。

斑馬魚的鰭再生過程分為五個階段：尾鰭丟失后，為了減少負面影響，抑制損傷部位的出血，防止微生物的擴張，其中許多微生物可能對魚類具有致病性。
為了吸引免疫細胞到傷口，頭一個危險信號是由活性氧(ROS)發(fā)出的，它在截肢部位起著趨化作用。然后一系列重疊的信號分子，包括趨化因子，吸引免疫細胞，基本上是中性粒細胞，在幾分鐘內(nèi)到達。如果血管遭到破壞，中性粒細胞就會形成血凝塊來止血。此外，中性粒細胞在損傷部位聚集并清除抗原碎片(如下圖2)。

骨髓細胞在鰭再生中的作用尚不*清楚，然而，近來的一項研究顯示巨噬細胞和中性粒細胞向損傷組織遷移的時間依賴方式。以往的研究表明，中性粒細胞消融可導(dǎo)致再生率的升高，而二苯碘氯銨抑制中性粒細胞補充到損傷部位并不影響組織修復(fù)率。另一方面，巨噬細胞清除作用導(dǎo)致尾鰭生長顯著減少，鰭形態(tài)發(fā)生改變，包括異常的組織生長區(qū)域、骨射線模式缺陷和異質(zhì)骨鈣化。
巨噬細胞是免疫系統(tǒng)的第二個主要角色，它調(diào)節(jié)組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)，器官修復(fù)和血管生成，遷移到傷口并分泌生長因子和細胞因子。進而激活細胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生，該產(chǎn)物存在于所有組織中并調(diào)節(jié)傷口的愈合，從而提供保護受損區(qū)域的貼劑。
與斑馬魚和其他*再生的物種相反，哺乳動物在截肢后通過纖維連接蛋白和膠原蛋白(ECM的主要成分)的沉積形成瘢痕組織，導(dǎo)致纖維化。在斑馬魚中，當(dāng)尾鰭截肢后的出血停止后，纖維蛋白和纖維連接蛋白的數(shù)量就會減少，這是防止瘢痕形成的原因，因為當(dāng)傷口閉合時，被稱為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的蛋白水解酶會重塑基質(zhì)蛋白來保護愈合的器官或組織，以及遷移的細胞來取代失去的組織。
雖然基質(zhì)金屬蛋白酶參與組織重塑、細胞遷移和增殖、血管生成和凋亡以及ECM蛋白降解，對正常胚胎發(fā)育至關(guān)重要，但它們在肢體再生中的作用卻鮮有報道。研究表明，再生尾鰭的芽基和基底上皮層均表達MMP基因，而抑制MMP活性的酶GM6001的存在導(dǎo)致了鰭生長受限。研究還表明，MMP酶影響趨化因子的激活，這些趨化因子刺激免疫細胞向損傷部位遷移，維持正常的穩(wěn)態(tài)，并在胚胎發(fā)生和再生過程中控制細胞遷移。增加GM6001濃度導(dǎo)致白細胞減少，負調(diào)控對損傷的免疫反應(yīng)。
Hasegawa等研究了促炎細胞因子白細胞介素-1β (illb)對幼蟲鰭褶再生的影響。并發(fā)現(xiàn)尾鰭截肢導(dǎo)致上皮細胞中illb表達增加，從而觸發(fā)再生誘導(dǎo)基因。然而，在沒有巨噬細胞的情況下，該細胞因子的過度表達導(dǎo)致再生細胞凋亡。因此，巨噬細胞在再生過程的后續(xù)階段中起著重要的作用。另一種促炎細胞因子TNF-α被認為是尾鰭再生的重要組成部分。作為Wnt/ b-catenin信號通路的下游元素，這種抗炎細胞因子由M1樣巨噬細胞合成到損傷區(qū)域，具有增強巨噬細胞積累和參與胚芽形成的雙重作用。
透明質(zhì)酸在再生鰭的ECM中非常豐富。透明質(zhì)酸合酶3 (has3)基因在尾鰭截肢后6小時內(nèi)表達，24小時內(nèi)增加到其超大濃度。由該基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生分子量不同、具有不同生物學(xué)功能的透明質(zhì)酸。短的透明質(zhì)酸聚合物與鰭再生有關(guān)。在截肢后24小時抑制透明質(zhì)酸的合成會抑制胚泡的形成和再生，而在后期抑制則不會顯著影響再生過程。研究結(jié)果表明，透明質(zhì)酸分子會激活胚泡形成所需的信號級聯(lián)，因為抑制了透明質(zhì)酸的合成。消除了某些母細胞特定的標(biāo)記。
在1-3天內(nèi)，該部位被遠端不擴散的上皮細胞形成的多層傷口表皮覆蓋。隨著時間的推移，傷口表皮增加規(guī)，并建立了頂端表皮蓋，這在以下方面起到了一物理屏障的作用。在18-24小時，傷口表皮下的間充質(zhì)細胞，主要是成骨細胞和成纖維細胞，失去其組織并轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨仍鲋车陌咨捶只毎?，稱為胚芽。胚芽在2天的過程中會增大。
建立合適的胚芽對于正常的再生至關(guān)重要，包括血管、神經(jīng)、骨成分和結(jié)締組織的正常再生，所以當(dāng)初的48 h至關(guān)重要，適當(dāng)激活所有啟動再生的主要機制(如下圖3)。

胚芽有兩種功能：支持生長和形成鰭恢復(fù)所需的特定結(jié)構(gòu)元素，主要受wnt /b-catenin、聲波刺猬(Shh)、成纖維細胞生長因子(FGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、激活素、胰島素樣生長因子(IGF)、Notch和RA(維甲酸)通路的調(diào)控。
Hedgehog基因是脊椎動物胚胎發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，它啟動適當(dāng)?shù)某晒羌毎婕毎?pObs)分化和鰭射線分叉，從而調(diào)節(jié)基底上皮細胞和pObs之間的細胞間相互作用。Shh的激活使表皮細胞暫時分裂成簇。護送成骨祖細胞(pObs)再生具有典型分支結(jié)構(gòu)或分叉的空心圓柱形骨射線。在甾體生物堿環(huán)巴胺的作用下，Shh被阻斷，可導(dǎo)致畸胎瘤和腫瘤減少。如果Shh過度表達，會導(dǎo)致腫瘤、不適當(dāng)?shù)募毎鲋澈驮偕掃^度的骨沉積。環(huán)巴胺抑制損傷組織中Shh信號通路，導(dǎo)致Wnt/b-catenin、FGF和RA基因表達受到抑制，從而導(dǎo)致再生能力喪失。然而，Wnt通路的激活導(dǎo)致再生過程的恢復(fù)。因此Shh是該通路的上游調(diào)控因子。
在胚芽建立的水平上，調(diào)節(jié)干細胞多能性的典型信號通路Wnt/b-catenin對胚芽形成至關(guān)重要，而胚芽形成又對進一步的發(fā)育至關(guān)重要。Wnt/b-catenin只在胚基遠端有限數(shù)量的非增殖細胞中起作用，并直接調(diào)節(jié)成骨細胞分化，從而影響骨形成。有人提出，除了Wnt/ b-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能外，還要在胚芽內(nèi)建立組織中心，從而調(diào)節(jié)胚芽的活性。其他信號通路，如Fgf和Bmp，他們控制細胞的增殖、分化、和組織恢復(fù)。長期抑制Wnt/b-catenin信號通路會阻斷斷鰭的再生生長。
Wnt/b-catenin抑制劑糖蛋白Dkk1的超表達可抑制腫瘤發(fā)生和細胞增殖，導(dǎo)致胚芽形成停止，通常還會導(dǎo)致再生過程停止。據(jù)報道，這種拮抗劑可調(diào)節(jié)爪蛙X.的心臟組織形成?？梢?，敲除Dkk1基因會導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育過程中肢體和大腦發(fā)育受損。因此，正常的Wnt/b-catenin/Dkk1相互作用似乎是鰭再生啟動成功所需的。隨著Dkk1暫時性的過度表達，重復(fù)截肢重新啟動了正常的再生過程，導(dǎo)致了正常的結(jié)構(gòu)恢復(fù)。有趣的是，遠端芽基細胞在再生組織中產(chǎn)生Wnt蛋白梯度，直接或間接地調(diào)節(jié)各種細胞群。
FGF在鰭再生的早期階段表達，并控制成骨細胞的形成、成骨細胞的去分化和增殖、放線菌的再生以及隨后的鰭的恢復(fù)。FGF通路調(diào)控錯誤會導(dǎo)致嚴重的異常，如腫瘤。成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)對細胞的有效再生有重要作用。FGFR1對于維持表皮細胞和胚細胞亞群以啟動胚基增殖至關(guān)重要。在fgf20a基因被暫時敲除的突變斑馬魚中，上皮細胞覆蓋了損傷部位，但沒有被胚芽細胞取代，這與野生型魚類似。這一修改在48小時停止了再生過程。傷口*愈合了，沒有復(fù)原失蹤的鰭。FGFRs的暫時抑制導(dǎo)致節(jié)段間關(guān)節(jié)和骨單元的病理變化。使用熱休克或化學(xué)試劑在截肢后2天抑制offgf信號通路導(dǎo)致胚基發(fā)育不全，這證明了FGF不僅對重新合成至關(guān)重要，而且對維持現(xiàn)有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也至關(guān)重要。該途徑激活后，包括芽基和放線菌在內(nèi)的所有結(jié)構(gòu)均可重新啟動再生過程，重建其結(jié)構(gòu)和功能。
Notch信號通路是胚胎發(fā)生過程中細胞穩(wěn)態(tài)的普遍調(diào)節(jié)因子，對維持成體組織的完整性非常重要。通過細胞間的相互作用，Notch通路控制鄰近細胞的發(fā)育，并調(diào)節(jié)它們的自我更新、生長、生存、分化和通過凋亡死亡的能力。近來的研究表明，再生過程的控制依賴于維持胚細胞的增殖狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)Notch在尾鰭截肢時被激活，但不參與芽基形成后的細胞遷移或去分化。
Bmp包含了一個來自轉(zhuǎn)化生長因子-β家族的大亞群配體。在人類中，BMP信號是由BMP二聚體結(jié)合到細胞表面的多聚復(fù)合體開始的，該多聚復(fù)合體由具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的BMP受體1型和2型的同源二聚體組成。配體結(jié)合后，BMP受體1二聚體磷酸化BMP受體2二聚體，并啟動其激酶活性，刺激下游介質(zhì)的作用。BMP受體磷酸化的主要靶點是SMAD蛋白，這是一種從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核的纖維化調(diào)節(jié)蛋白，在細胞核它們以SMAD結(jié)合基序與DNA結(jié)合，導(dǎo)致組織特異性基因表達。幾乎所有類型的再生鰭組織中都表達了1型Bmp受體的不同同源物。
BMP在遠端胚、傷口表皮、成骨細胞和再生組織的血管中具有活性。當(dāng)初，Bmp對神經(jīng)叢的血管重塑至關(guān)重要。此外，它促進膠原纖維沉積到基膜，同時關(guān)閉傷口，誘導(dǎo)光化毛的形成。1型受體的藥理抑制可導(dǎo)致芽基形成后3 dpa再生阻滯，影響傷口表皮結(jié)構(gòu)。傷口表皮Bmp通路的損害阻礙了放線菌的形成。Bmp信號的抑制導(dǎo)致毛細血管形成異常，導(dǎo)致血液循環(huán)受損。
RA是斑馬魚骨再生過程中成骨細胞再分化和去分化的重要效應(yīng)分子。在生長過程中，RA正向調(diào)節(jié)成骨細胞的骨基質(zhì)合成。在尾鰭內(nèi)建立了骨基質(zhì)合成和降解之間的平衡，以提供柔性和剛度的很好組合。在未損傷的尾骨中，這種平衡主要由兩種蛋白質(zhì)控制：合成RA的成纖維細胞中的Aldh1a2和降解RA的成骨細胞中的Cyp26b1。截肢后，RA信號應(yīng)被Cyp26b1抑制，以提供成骨細胞去分化所需的條件。
然而，成骨前細胞的增殖受到RA的正調(diào)控，阻止它們的再分化，并可能干擾BMP信號，上調(diào)Wnt/b-catenin通路。前成骨細胞的再分化是由于近端產(chǎn)生Cyp26b1的囊胚細胞產(chǎn)生近端至遠端RA濃度梯度，而RA主要分泌在遠端。近來的一項研究表明，NF-jB是成骨細胞去分化和再分化過程中RA信號的上游調(diào)控因子。Mishra等人提出了一個模型，根據(jù)該模型，在截肢后，由于未知的損傷誘導(dǎo)信號的作用，NF-jB被下調(diào)。下調(diào)NF-jB誘導(dǎo)成骨細胞中cyp26b1的表達，刺激其去分化(圖4)。

IGF是進化上的保守蛋白，調(diào)節(jié)細胞生長、存活和代謝過程。IGF信號通路的作用主要通過IGF-1受體介導(dǎo)，IGF-1受體具有酪氨酸激酶活性，與配體結(jié)合后可磷酸化下游靶點。IGF信號通路的下游級聯(lián)包括Ras-MAPK和PI3-kinase通路。Chablais和Jazwinska證明了建立正確的IGF信號是鰭再生的必要條件。其中，胰島素樣生長因子2b (igf2b)在72小時的胚芽表達量比斷肢組織增加了5倍。有趣的是，IGF1型酪氨酸激酶受體(IGF1R)的激活不是在胚芽中，而是在傷口表皮中。使用morpholino寡核苷酸和IGF1 atp結(jié)合位點的藥物阻斷劑抑制IGF信號，可導(dǎo)致異常的再生，損傷或截肢后24小時，再生率降低42%-48%。由于IGF1R活化的抗凋亡作用，IGF信號可能對創(chuàng)面表皮的建立起重要作用。例如，傷口表皮形成過程中抑制IGF信號與55- 95倍的凋亡增強有關(guān)。然而，如果魚在傷口上皮形成后使用igf1r抑制劑，則不會出現(xiàn)大量的細胞凋亡。盡管沒有igf1rinblastema的調(diào)控，但抑制這一信號通路會導(dǎo)致細胞增殖缺陷和囊胚標(biāo)記物msxB和fgf20a的表達缺失。
激活素是一種配體，屬于TGF-β家族。這些配體與激活素1型和2型受體的結(jié)合觸發(fā)Smad蛋白的激活，這是由于受體胞內(nèi)區(qū)域的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。激活后，Smad復(fù)合物改變了細胞核中多個基因的表達。激活素信號在斑馬魚再生中起重要作用。Jaz´win´ska等人證明，與若干TGF-β配體(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)基因和節(jié)點相關(guān)基因相比，后鰭中激活素- βA的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。在24小時，activin-βA表達峰值為18小時(增加18倍)，而在24小時時略有下降。在胚基形成之前，激活素1型受體的藥理抑制導(dǎo)致了受損的傷口邊緣修復(fù)，這是由于有缺陷的間充質(zhì)重塑，與未受抑制的對照組相比，細胞增殖減少了75%。在囊胚形成后，用激活素1受體抑制劑處理截斷的斑馬魚，在12小時內(nèi)可顯著降低囊胚細胞的增殖，并降低24小時后囊胚標(biāo)記物msxB的表達。通過使用activin-βA和寡核苷酸對激活素信號通路的損害，Jaz´win´ska和同事發(fā)現(xiàn)再生能力降低了50%-80%。因此，即使在正常啟動過程之后，鰭生長過程中激活素信號的損傷也導(dǎo)致再生缺陷。
為了使間充質(zhì)細胞去分化，強甲基化基因通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(dnmt)的作用去甲基化，該酶從胞嘧啶中去除甲基基團，將異染色質(zhì)轉(zhuǎn)化為其活性形式常染色質(zhì)。調(diào)查顯示5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶水平在截肢后和隨后的36小時內(nèi)立即下降，并在再生過程完成后恢復(fù)到正常水平。這表明一個或多個dnmt基因以及由這些基因編碼的蛋白質(zhì)表達增加。這些基因的突變可以阻止體細胞和干細胞的正常去分化，并損害再生過程。在蠑螈中獲得了與魚類相似的結(jié)果，證實了dnmt3a和dnmt1在胚芽中的水平高于其他細胞。
在斑馬魚中，間充質(zhì)細胞增殖階段之前，成熟成骨細胞去分化，轉(zhuǎn)化成成骨前體，為新形成的骨結(jié)構(gòu)提供來源。骨鈣素(一種骨Gla蛋白，是成熟成骨細胞的標(biāo)志)的濃度在24小時損傷部位顯著降低，在48小時的鰭段顯著降低。相比之下，哺乳動物的間充質(zhì)干細胞可以產(chǎn)生成骨細胞，而成骨細胞又可以大量合成骨鈣素。因為烏骨木是四肢的組成部分，這可能是人類肢體再生的限制因素之一。
在去分化過程中，細胞核和細胞質(zhì)都會發(fā)生變化，導(dǎo)致新的蛋白質(zhì)的合成和不再需要的蛋白質(zhì)自噬降解。當(dāng)胚芽形成時，自噬水平較高，自噬失活導(dǎo)致細胞凋亡。根據(jù)一些報道，斑馬魚經(jīng)自噬抑制劑巴菲霉素處理后，與對照組相比尾部長度縮短。巴菲霉素并不是抑制自噬激活的抗生素。負調(diào)控自噬的藥物包括氯喹。
為了啟動異形再生，增加正常有絲分裂細胞的增殖，并重新激活負責(zé)胚胎發(fā)育的基因。其中一個靶基因fam53b/simplet (smp)在遠端間充質(zhì)中高表達，導(dǎo)致了再生早期階段的快速增殖。在再生生長的過程，促進再生組織的生長。該基因的暫時阻滯導(dǎo)致細胞數(shù)量減少，不能恢復(fù)尾鰭的原始結(jié)構(gòu)。
在24小時smp表達受到抑制，組成胚芽的細胞分裂為遠端胚芽，表達msxb、msxc和slg1，增殖緩慢，有絲分裂G2期一般長于6小時，近端胚芽，表達mps1、hsp60和pcna，增殖迅速。遠端胚芽的標(biāo)記基因，如slyl1和msxc，不導(dǎo)致細胞增殖，但支持組織內(nèi)細胞數(shù)量的穩(wěn)態(tài)；而mps1，一種有絲分裂絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，影響受控細胞分裂。當(dāng)新產(chǎn)生的細胞遷移到新的位置、分化并取代切除的射線時，遠端芽基對近端芽基起著關(guān)鍵作用。
在鰭狀結(jié)構(gòu)中，由于放線菌先于鱗毛菌形成，因此負責(zé)膠原蛋白生成的基因表達是重要的。放線菌由彈性素構(gòu)成，作為皮膚褶皺的骨骼支持和間充質(zhì)細胞向損傷部位遷移的基質(zhì)。所有的膠原成分由col1a1a, col1a1b, col1a2基因和II型膠原編碼。非膠原成分是由肌動蛋白基因家族編碼的。斑馬魚是硬骨魚的代表，象鯊是軟骨魚的一種，它們具有形成actinotrichia所需的特殊蛋白actinodin 1 (And1)和actinodin 2 (And2)。對斑馬魚胚胎中And1和And2基因的雙敲除導(dǎo)致了放線菌的缺失，從而導(dǎo)致了鰭的從頭形成。
除了尾鰭鰭條的正常再生外，重要的是建立鰭的初始大小，它與總體長成比例增長。這種調(diào)節(jié)受鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(也稱為PP2B)的控制，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種負責(zé)生長的蛋白質(zhì)磷酸酶。抑制劑FK506和環(huán)孢素A抑制鈣調(diào)磷酸酶后，尾鰭出現(xiàn)過度再生生長。
再生的持續(xù)時間已被證明依賴于切斷結(jié)構(gòu)的長度。近端切除比遠端切除再生的時間更長。不管它們在背/腹軸上的位置如何，所有的鰭條都以相同的速度再生，結(jié)束是結(jié)構(gòu)和功能再生尾鰭的完成(如圖5)。

四、影響鰭再生的因素：
鰭的再生與生物體內(nèi)發(fā)生的任何過程一樣，都取決于許多環(huán)境因素，在計劃實驗時考慮到這些因素。壓力是影響炎癥、再生和免疫反應(yīng)等過程的關(guān)鍵因素之一，產(chǎn)生焦慮和抑郁，從而抑制生理功能。在脊椎動物中，糖皮質(zhì)激素血漿水平升高被認為是應(yīng)激的表現(xiàn)。應(yīng)激源激活下丘腦/垂體/腎間軸，通過糖皮質(zhì)激素受體，如應(yīng)激激素和熱休克蛋白的產(chǎn)生，導(dǎo)致多種生理過程的調(diào)節(jié)。代謝變化增加血糖原水平和減少組織糖原，啟動免疫系統(tǒng)激活和滲透調(diào)節(jié)變化。應(yīng)激魚可能通過生理變化或行為，如攻擊、運動減少和進食行為的改變來檢測。
由化學(xué)、生理或心理應(yīng)激因素引起的急性或慢性應(yīng)激，如溫度、高飼養(yǎng)密度、飲食、化學(xué)制劑、捕食者的出現(xiàn)、新坦克以及捕獲和處理，都會增加全身皮質(zhì)醇的濃度。短期壓力可以增強免疫過程;而長期的慢性壓力會抑制再生過程。已證實，高糖皮質(zhì)激素水平會引發(fā)代謝功能障礙、組織降解和程序性細胞死亡。
溫度：
溫度是斑馬魚生理狀態(tài)和行為的重要調(diào)節(jié)因子。為了超大限度地提高生長、采食量、飼料轉(zhuǎn)化率和胃排空，保持一致的水溫是很重要的。據(jù)報道，斑馬魚胚胎的溫度是27℃，22 ℃和32 ℃代表正常生長和發(fā)育的下限和上限。在一項短期暴露于兩種溫度之一的研究中，胚胎在常溫下被培養(yǎng)到成熟。根據(jù)游泳性能測試，由于負責(zé)游泳和主動運動的肌肉纖維組成的不同，兩組人群的熱敏感性都降低了。從胚胎和早期生活階段所處的熱環(huán)境轉(zhuǎn)移到不適應(yīng)的溫度環(huán)境會引起慢性應(yīng)激，這將對組織和器官的再生產(chǎn)生負面影響。
在允許(25℃)和限制(33℃)溫度下的再生研究中，在8天時較高溫度下再生率達到60%，而在25℃，在第15天達到這一點。
其他作者證明，魚恒溫處于37℃1小時皮質(zhì)醇濃度是對照組的10-40倍。即使是短暫地將魚暴露在*的溫度下也可能導(dǎo)致死亡。雖然單一的急性應(yīng)激沒有被證明會嚴重影響再生，但重復(fù)應(yīng)激顯著降低了截肢結(jié)構(gòu)的*再生。在定期的熱休克導(dǎo)致心肌損傷后，只有25%的魚成功替換了膠原組織并再生了損傷部位。
飲食：
自噬被認為是維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機制。它誘導(dǎo)去除聚集和錯誤折疊的蛋白質(zhì)；核糖體、線粒體等細胞器受損；防止壞死；規(guī)范細胞廢物的回收。在斑馬魚中，正常功能的自噬對于維持干細胞的再生能力很重要。基因突變、基因敲除或敲除或化學(xué)或藥物抑制自噬的魚類，表現(xiàn)出細胞死亡水平增加，以及去分化和胚芽增殖的抑制，損害尾鰭再生。
短期饑餓會迅速激活自噬反應(yīng)，進而參與ATP的產(chǎn)生和蛋白質(zhì)的從頭合成。許多種類的魚可以忍受在遷徙、季節(jié)變化、產(chǎn)卵期、缺氧和缺水以及溫度波動期間食物的缺乏。一段時間的食物剝奪不一定會對身體活動或細胞過程產(chǎn)生負面影響，但會加速其關(guān)鍵階段的再生。
飲食和飼料補充劑:
不同的商業(yè)飼料對生長、性成熟年齡、生育力、活力和再生有不同的影響。對于正常的斑馬魚組織再生，使用氨基酸、脂肪酸、維生素、碳水化合物和礦物質(zhì)的比例的飼料，并建立一個適當(dāng)?shù)奈桂B(yǎng)制度。
從細菌、真菌、酵母、藻類或植物中提取的多糖1,3 - 1,6 - β-葡聚糖已被評價為斑馬魚的飼料補充劑。補充劑量0.35g 1,3 - 1,6 - β-葡聚糖飼養(yǎng)14天與降低死亡率和增加尾鰭再生面積有關(guān)。1,3 - 1,6 - β-葡聚糖被稱為免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑，通過不同途徑增強免疫反應(yīng)。雖然硬骨魚中尚未確定具體的1,3 - 1,6 - β-葡聚糖靶點，但哺乳動物c型凝集素受體家族的同源物被認為負責(zé)巨噬細胞的活化。一些β-葡聚糖受體的候選基因已經(jīng)在鯉魚巨噬細胞中被鑒定。類似的研究表明，由于刺激體液和細胞過程，它們誘導(dǎo)免疫抵抗細菌和病毒的入侵。在鯉魚、鱒魚和鮭魚中，含有β-葡聚糖的食品添加劑通過激活巨噬細胞來保護免疫系統(tǒng)。維生素A (RA)是一種重要的信號分子。以濃度為2、4、8 IU/mL的維生素A處理Oreochromis niloticus，沒有發(fā)現(xiàn)改善再生的跡象。然而，RA影響了再生鰭的形態(tài)：與對照組相比，治療組再生的射線節(jié)數(shù)更高，維生素A抑制骨節(jié)之間結(jié)締組織的生長，導(dǎo)致相鄰射線的融合。新生的一條鰭條通常分為兩條子鰭條。RA是維生素A的代謝物，在濃度為10-6M的二甲基亞砜(DMSO)中溶解，暴露在水中的魚，這些子射線融合成一條射線。
維生素C、抗壞血酸，參與多種酶反應(yīng)，是一種*的抗氧化劑。維生素C可以保護身體免受自由基和氧化應(yīng)激，消耗ROS。斑馬魚和人類一樣，不能產(chǎn)生這種維生素，從飲食中獲取。在維生素C缺乏的情況下，魚類經(jīng)歷氧化應(yīng)激，嘌呤核苷酸循環(huán)中的代謝物水平增加，導(dǎo)致細胞能量代謝的改變。經(jīng)歷嚴重氧化應(yīng)激的魚類在肝臟、大腦、肌肉、腸道和其他重要器官的功能上表現(xiàn)出嚴重的異常，沒有這些異常，再生就無法順利進行。
過量飼喂:
與之前發(fā)表的文章相反，一些作者報告稱，持續(xù)幾周的過度喂養(yǎng)和高脂肪飲食不會導(dǎo)致體重差異，但斑馬魚的認知功能受損，可能與人類的認知障礙不相上下。與攝入3.79千卡/克熱量的魚類相比，攝入4.90千卡/克熱量的魚類在端腦(負責(zé)回憶信息的大腦區(qū)域)的97個基因表達較低。這可能會對再生產(chǎn)生長期的負面影響，因為有效的再生依賴于維持正常生理和生物功能活力的能力，而這種能力是由大腦支持的。研究顯示，過度喂食會以一種性別特異性的方式改變斑馬魚的腸道微生物群，這可能與肥胖和相關(guān)疾病有關(guān)。
過度喂養(yǎng)已被證明會影響成骨，這是鰭再生的一個主要因素，是斑馬魚鰭條形成的必要因素。高脂肪飲食已被證明會改變斑馬魚的血糖和胰島素濃度，使體重增加23%，并導(dǎo)致鱗片邊緣被吸收，這表明骨礦化失敗。抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，一種破骨酶，顯示增加，而堿性磷酸酶，引發(fā)骨礦化，減少了食用高脂肪飲食的魚類。這種不平衡導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨形成受損。
放養(yǎng)密度:
雖然斑馬魚作為一種模式生物的重要性正在增加，但其養(yǎng)殖的放養(yǎng)密度仍未確定。一些研究報告，密度為12-15尾魚/升曝氣水。人口過剩不僅對再生產(chǎn)生負面影響，而且會抑制所有的生理過程。據(jù)報道，斑馬魚對擁擠(>10魚/0.25L)敏感，作為一種生物應(yīng)激源。在一項關(guān)于魚類應(yīng)激的研究中，擁擠狀態(tài)下的全身皮質(zhì)醇濃度是熱休克狀態(tài)下的兩倍，接近每克80 ng魚。只有33%暴露在擁擠環(huán)境中的魚成功地再生了心肌。在類似的研究中，將魚在40尾魚/L的密度下保持3小時誘導(dǎo)急性應(yīng)激，5天誘導(dǎo)慢性應(yīng)激。在這兩種魚類中，整個身體的皮質(zhì)醇濃度大約是對照組維持在0.25尾魚/升的四倍。雖然斑馬魚是高度群居的物種，但0.13、0.30和1.2尾魚/L的低飼養(yǎng)密度與水箱水中溶解的皮質(zhì)醇濃度沒有顯著差異。
水族館設(shè)備:
水族設(shè)備在細胞增殖過程中發(fā)揮了重要作用。作者測量了將斑馬魚分別放在充滿礫石和人工植物的水族箱中，或在貧瘠的水族箱中進行活躍分裂的神經(jīng)元數(shù)量。與那些在沒有水的罐子里的魚相比，在富水的罐子里的魚的皮質(zhì)醇水平略有升高。這可能會對細胞增殖產(chǎn)生負面影響，但短期暴露在含有不熟悉元素的新環(huán)境中(6分鐘和30分鐘)不僅會激活應(yīng)激反應(yīng)，還會對大腦的再生過程產(chǎn)生刺激作用。環(huán)境的改變可能會改變魚類的移動能力、食物攝取能力和魚群學(xué)習(xí)能力，進而影響再生。并沒有導(dǎo)致魚類行為或皮質(zhì)醇水平的差異。
化學(xué)藥劑：
化學(xué)制劑，如咖啡因，尼古丁，乙醇，添加到水箱可能是抑制劑或促進再生?？Х纫驎黾有穆?，加速氧氣輸送到組織和器官，這可能會影響再生。本研究介紹了在咖啡因影響下魚類的行為評估結(jié)果。暴露在咖啡因下的斑馬魚在水箱底部待的時間更長，表明它很焦慮。應(yīng)激行為意味著機體反應(yīng)受到抑制，從而導(dǎo)致再生遲緩。為了分析咖啡因的影響，斑馬魚被暴露在濃度為0.5-150 mg /L的咖啡因中60分鐘。濃度大于50 mg/L時，魚游的距離較濃度為0 ~ 25 mg/L時降低。暴露于濃度大于50 mg/L的咖啡因會增加冷凍行為和在罐底停留的時間。
在許多動物中，白細胞被細胞因子和ROS等促炎物質(zhì)吸引到損傷部位。在尾鰭截肢后立即產(chǎn)生ROS，在20分鐘后達到峰值濃度。*濃度已被確定為白細胞聚集到傷口的關(guān)鍵介質(zhì)。近來的研究表明，廣泛應(yīng)用于抗菌傷口敷料等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的銀納米顆粒抑制了斑馬魚的再生過程。傷口愈合過程的損傷是階段性的，影響傷口上皮化和早期胚芽的形成。據(jù)報道，銀納米顆粒處理可導(dǎo)致18 - 36小時期間ROS生成減少，并顯著增加聚集的中性粒細胞數(shù)量?；钚缘?RNS)是另一組炎癥介質(zhì)。亞硝酸鹽和一氧化氮對斑馬魚再生的研究表明，在缺氧條件下，RNS是中性粒細胞適當(dāng)補充到損傷部位所需的。亞硝酸鹽處理冷凍損傷的心臟組織可促進心肌細胞增殖和血管生成。
糖皮質(zhì)激素潑尼松龍會影響斑馬魚的骨形成和成骨細胞分化，并增加再生時間。糖皮質(zhì)激素治療改變再生組織的蛋白表達模式。潑尼松龍暴露尤其影響參與溶酶體酸化的轉(zhuǎn)運體的表達，以及那些參與囊泡運輸和分泌的轉(zhuǎn)運體。因此，鈣轉(zhuǎn)運atp酶也過表達，導(dǎo)致骨礦化改變。
五、結(jié)論
這只是再生醫(yī)學(xué)中斑馬魚研究的開始。本文并沒有對尾鰭再生的各個方面進行全面的綜述，但對尾鰭再生的調(diào)控機制仍有很多未知。在計劃實驗時，考慮促進或抑制組織再生的多種環(huán)境因素。
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