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文丨Kristin Dietrich, Imke AK Fiedler,Anastasia Kurzyukova,Alejandra C López-Delgado,Lucy M McGowan, Karina Geurtzen,Chrissy L Hammond,Björn Busse,and Franziska Knopf
翻譯丨郭勝亞
發(fā)表于《Journal of Bone and Mineral Research》, Vol. 36, No. 3, March 2021, pp 436–458.

核心摘要
斑馬魚是硬骨魚(bony fish)，與哺乳動物有共同的祖先，屬于骨魚門，它們的骨骼系統(tǒng)繼承自骨魚門。事實上，硬骨動物和哺乳動物在骨骼元素、骨化機(jī)制和骨基質(zhì)成分方面有許多共同的遺傳保守特征。
然而，在骨骼研究中對斑馬魚進(jìn)行研究時，需要考慮與骨形態(tài)和功能相關(guān)的差異。本文就斑馬魚的骨骼結(jié)構(gòu)、脊柱形態(tài)及相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜述。我們概述了斑馬魚不同的骨化類型和骨細(xì)胞，并在顯微組織水平描述骨基質(zhì)組成，重點評估礦化。正如我們在這里所闡述的，骨骼形成的過程也強烈地依賴于斑馬魚的負(fù)重。
一、斑馬魚概述
在基礎(chǔ)和臨床前研究中，斑馬魚已成為研究骨骼發(fā)育和疾病的重要模式生物。這些硬骨魚的潛力在于它們的小體型，容易照顧，遺傳順從，和高再生能力。此外，由于胚胎和幼蟲階段的透明性，利用影響特定細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)基因和突變株，可以更詳細(xì)地監(jiān)測骨生成和成骨細(xì)胞的活性。
這與胚胎、幼蟲和成年個體長期體內(nèi)成像的可行性相結(jié)合，從而將斑馬魚與其他脊椎動物模型(如嚙齒動物)區(qū)分開來，在嚙齒動物模型中，體內(nèi)成像具有挑戰(zhàn)性(表1)。
重要的是,斑馬魚的基因組包含約82%的人類疾病相關(guān)基因的同源基因，包括那些影響骨骼的基因。通過位點特異性重組酶(Cre)的組織特異性過表達(dá)和通過聚類規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)-Cas9的基因特異性敲除，以及反義寡核苷酸基因敲除方法在斑馬魚中都是可行的，這是進(jìn)行正向和反向遺傳篩選的理想條件。
此外，單核苷酸基因組編輯可以通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的敲除蛋白完成。藥物可以通過多種方式給斑馬魚用藥，包括直接將化學(xué)物質(zhì)溶解在斑馬魚水/培養(yǎng)基中，這是藥物篩選的方法(如下圖表1)。

以上描述說明了斑馬魚研究骨骼生物學(xué)和疾病的潛力。斑馬魚作為骨骼研究模型的各個方面都得到了很好的評價。在這里，我們旨在通過介紹斑馬魚的骨骼結(jié)構(gòu)和模式、細(xì)胞類型和基質(zhì)礦化(依賴于負(fù)載)的基本信息，將斑馬魚介紹給更廣泛的骨骼研究群體。
二、斑馬魚骨架的結(jié)構(gòu)

圖1所示 斑馬魚的骨架。(A)顱面和軸向骨骼的μ CT圖像，包括由韋伯式的設(shè)備組成的脊柱、腹部(也稱為前尾或胸)、尾、尾鰭椎骨。Hox基因表達(dá)模式顯示。與哺乳動物骨骼相似，斑馬魚的肋骨與腹椎骨相連，保護(hù)內(nèi)臟器官。(B)腹部和尾椎的近景。兩個相鄰的雙錐形椎體(左)矢狀面顯示神經(jīng)弓向背側(cè)延伸并包圍神經(jīng)根。從腹椎骨向腹側(cè)延伸的肋骨是鉸接的，而尾椎骨延伸到包圍尾動脈和靜脈的血管弓。正面圖(右)顯示未礦化的椎體中心，包含脊索和空泡性軟組織(未顯示)。環(huán)狀椎體終板區(qū)域由IVL連接(圖中未顯示)，與斑馬魚的椎體生長區(qū)相對應(yīng)。參數(shù)，包括VBL, V.Th和BV/TV，提供了有價值的措施來量化椎體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。BV/TV =骨體積分?jǐn)?shù);IVL =椎間韌帶;VBL =椎體長度;V.Th =椎厚度。
脊椎動物的骨骼一般分為外骨骼和內(nèi)骨骼。斑馬魚骨骼的突出部分如下:(i)顱面骨骼，包括頂骨、頜骨和蓋鰓的骨;(ii)軸向骨骼包括脊柱、肋骨、肌間骨以及非成對的背鰭、肛鰭和尾鰭(圖1A).。斑馬魚的性成熟時間為90天，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)長度(SL;從吻部到成年個體的后尾椎)為1.5到2.0厘米。斑馬魚不斷生長，骨骼體積不斷增大，體長可達(dá)3至4厘米，通常壽命為3年左右(也可達(dá)到5年)。
成年斑馬魚的頭蓋骨由74塊顱面骨組成，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于哺乳動物的22塊頭骨。然而，斑馬魚的許多骨骼結(jié)構(gòu)在哺乳動物中有明顯的同源性，包括神經(jīng)顱的前部，它類似于哺乳動物的上顎，以及在斑馬魚和哺乳動物之間保留的顱穹窿。和哺乳動物一樣，斑馬魚頭骨的特征是骨骼關(guān)節(jié)，包括纖維關(guān)節(jié)(如顱骨縫合)和下頜關(guān)節(jié)。
在脊柱形態(tài)方面，斑馬魚的椎骨數(shù)量與人類相似(斑馬魚為30 - 32節(jié)，人類為33節(jié))，生理曲度與人類相似:肋骨保護(hù)內(nèi)臟的腹部區(qū)域脊柱后凸，尾端前凸。在顱尾目中，斑馬魚的脊椎由韋伯式的四節(jié)椎骨組成，連接著魚鰾和耳朵(對聲音的傳遞很重要)，10個腹椎骨(也稱為尾前椎骨或軀干椎骨)由桿狀肋骨節(jié)連接，過渡到14個尾椎和3個尾鰭椎骨。與哺乳動物的椎管相似，脊髓通過從每個脊椎骨向背側(cè)延伸的神經(jīng)弓。尾椎也有向腹側(cè)伸展并包圍尾動脈和尾靜脈的血管弓。
斑馬魚個體椎體中心的三維形態(tài)特征為其沙漏形狀(圖1B)與含有小梁骨和攜帶骨髓(BM)的哺乳動物脊椎骨不同，斑馬魚的脊椎體不容納紅色的BM，因為成年斑馬魚造血發(fā)生在腎臟(表1)。相反，它們充滿了空泡狀的脊索細(xì)胞，并被脂肪組織包圍。在個體椎骨狹窄的中心周圍發(fā)現(xiàn)了微米薄的小梁支撐。
雖然評估脊椎小梁骨(一種檢測哺乳動物骨骼脆性的方法)在斑馬魚中是有限的，但椎體中心的形態(tài)通常被用作衡量脊椎骨骼質(zhì)量的指標(biāo)。3D的形態(tài)學(xué)參數(shù),如椎體長度(VBL),骨體積(BV)、骨體積/組織體積(BV /TV),椎橫斷面厚度(V.Th)和偏心率(圓度)提取微計算機(jī)斷層掃描(μCT)掃描的斑馬魚脊柱(圖1B),允許定量的變化，例如，由于肌肉骨骼活動改變，衰老和疾病。
此外，血管弓和神經(jīng)弓的厚度和體積用于評估斑馬魚突變體的椎體形態(tài)。小型斑馬魚的一個優(yōu)點是可以在高分辨率下分析完整的骨骼(例如，全身的μ CT掃描，像素大小為1 μm2)，比在大型嚙齒動物物種中更快。這提供了一種可能性，既可以評估整個機(jī)體的整體三維形態(tài)，又可以同時在高分辨率下表征組織形態(tài)，這已在變形的骨關(guān)節(jié)炎椎體中完成。此外，縱向組織學(xué)切片或整片染色，如茜素紅染色，可以在顯微鏡分辨率下顯示完整的骨骼。

圖2所示 斑馬魚骨基質(zhì)成分的評估。(A)拉曼光譜可以繪制再生尾鰭骨(此處為7 dpa處的礦物與基質(zhì)比率)近端和遠(yuǎn)端截肢平面(箭頭)的礦物相關(guān)和蛋白質(zhì)相關(guān)特性。再生部位的拉曼光譜(灰色曲線),蛋白質(zhì)相關(guān)的峰包括酰胺I、酰胺III和羥脯氨酸，與礦物相關(guān)的磷酸鹽峰相比更顯著，反映出與天然骨組織相比更低的礦物-基質(zhì)比率(黑色曲線)。(B) qBEI可用于評估斑馬魚骨骼中的礦物密度分布(此處為脊柱矢狀面和終板區(qū)域特寫)。由感興趣區(qū)域內(nèi)的校準(zhǔn)像素強度生成的直方圖允許提取Camean、Capeak和Cawidth，以及具有Calow和Cahigh的區(qū)域。Cahigh=高礦化程度;Calow=低礦化程度;Camean= Ca均值含量;Capeak= Ca峰含量;Cawidth= Ca分布的異質(zhì)性;dpa =截肢后天數(shù);qBEI =定量背散射電子顯微鏡。
和哺乳動物一樣，斑馬魚的脊椎是由軟組織連接在一起的，這有利于運動，也增加了運動的范圍。
在哺乳動物中，椎間盤(IVD)由纖維軟骨軟骨(纖維環(huán))和髓核組成。相比之下，斑馬魚的椎間軟組織的特征是環(huán)狀韌帶(椎間韌帶[IVL])連接相鄰兩個椎體的外層圓形邊緣。雖然IVD在人體中的生理作用是阻尼重力載荷的壓縮力，但斑馬魚的脊柱是軸向加載的，這是由于在粘性的水中游泳產(chǎn)生的壓縮力和附著在椎骨上的肌腱直接傳遞的肌肉力。與重力垂直作用于脊柱的四足動物(如老鼠、狗)相比，斑馬魚在負(fù)重方面更具優(yōu)勢。
因此，它們?yōu)檠芯考怪妥甸g組織退行性變以及運動模式改變對骨-肌腱-肌肉單元的影響提供了一種有價值的工具，這可以通過組織學(xué)和*的x線成像方法在小型斑馬魚中進(jìn)行評估(圖2)。
三、斑馬魚軸向和鰭骨架的圖案
和其他脊椎動物一樣，斑馬魚骨骼的軸向模式表現(xiàn)在脊柱上，脊柱沿著前后軸被劃分為不同類型的脊椎。對小鼠和雞的研究揭示了不同類型脊椎的形態(tài)多樣性和軸向位置，這些脊椎對區(qū)域Hox基因表達(dá)編碼的位置線索敏感。
雖然人類中的HOX突變導(dǎo)致早期發(fā)育致死，但已經(jīng)描述了與HOX相關(guān)的軸向骨骼缺陷，以及四肢和顱面缺陷、關(guān)節(jié)炎和各種類型的癌癥。斑馬魚軸向骨骼的分區(qū)受到相同的機(jī)械控制，依賴于空間(和時間)共線性;即染色體上基因的物理序列與其表達(dá)前后邊界(和時間)之間的對應(yīng)關(guān)系(圖1A)。
哺乳動物基因組中有39個Hox基因分布在4個集群中，而斑馬魚有48個基因分布在7個集群中。這些差異是脊椎動物進(jìn)化過程中基因組復(fù)制和基因丟失的結(jié)果。
因此，Hox表達(dá)域和軸向結(jié)構(gòu)區(qū)劃性在斑馬魚和四足動物之間只有部分相同(如Hoxc6和Hoxd12，但Hox9不相同)。然而，研究胚胎和幼體斑馬魚的同源性轉(zhuǎn)化可能是揭示Hox蛋白多種調(diào)節(jié)功能的有用工具。

圖3所示  四肢和胸鰭芽的早期模式是相似的。(A - C)斑馬魚鰭芽的早期模式。(A)在12 hpf時的鰭誘導(dǎo):來自孢子蟲的RA激活信號，導(dǎo)致側(cè)板tbx5和遠(yuǎn)端芽Fgf信號的激活，建立AER。(B) Hox基因和shh在30hpf的早期表達(dá)。(C) Hox基因和shh在60hpf的表達(dá)。需要注意的是，在30 hpf和60 hpf處，后翅芽區(qū)的hoxd11表達(dá)域仍然局限于該區(qū)域。虛線=在芽適當(dāng)和鰭折邊界。(D)類似于A中描述的鰭芽誘導(dǎo)信號在小鼠E9位點出現(xiàn)。(E) Hox基因和shh在E10.5小鼠肢體中的早期表達(dá)與在鰭芽中的B中觀察到的模式相似。hoxd9和hoxd10貫穿整個花蕾，而hoxd11、hoxd12、hoxd13和shh則局限于后端區(qū)域。(F) E12.5小鼠四肢Hox表達(dá)域與鰭芽C中Hox表達(dá)域的差異;hoxd11、hoxd12和hoxd13域向更前面延伸;噓的聲音僅限于臀部。從左到右=近端遠(yuǎn)端軸，從上到下=前后軸。E10.5 =胚胎期10.5天;E12.5 =胚胎期12.5天;E9 =胚胎第9天;hpf =受精后小時數(shù)。
在魚類中，軸向骨骼包括脊柱和相關(guān)的中鰭(背、肛和尾)，而成對的胸鰭和骨盆鰭位于腹部區(qū)域的腹外側(cè)。斑馬魚的背鰭和臀鰭的位置尚未被研究過，但推測可能與鯊魚一樣，是由Hox和Tbx基因的表達(dá)域決定的。
在Hox表達(dá)和維甲酸(RA)等誘導(dǎo)信號方面，胸鰭的發(fā)育與四足動物四肢的發(fā)育表現(xiàn)出高度的相似性，特別是在早期階段(圖3A-F)。在原腸形成過程中，RA負(fù)責(zé)邊緣區(qū)定位。
隨后，RA在體節(jié)中產(chǎn)生并激活中間中胚層的Wnt2b，而Wnt2b又激活側(cè)板中胚層的Tbx5 。Tbx5是前肢啟動過程中較早的轉(zhuǎn)錄因子，然后觸發(fā)成纖維細(xì)胞生長因子(Fgf)信號，建立轉(zhuǎn)錄級聯(lián)，調(diào)節(jié)肢體近端和遠(yuǎn)端模式。
在四足動物和魚,兩個信號附體的組織者在原基形成:頂端外胚層的脊(AER)遠(yuǎn)端芽,調(diào)節(jié)肢體和鰭產(chǎn)物通過Fgf信號和極化區(qū)活動(ZPA),后聲波刺猬的表達(dá)(噓)和調(diào)節(jié)前后的模式，非脊外表皮指示背腹模式。
雖然這些機(jī)制顯然是保守的，但鰭和肢在后期的調(diào)控和模式差異表明，表達(dá)模式和信號機(jī)制在進(jìn)化過程中已經(jīng)被修改，即在鰭到肢的過渡過程中，這可能導(dǎo)致了新骨骼特征的產(chǎn)生，比如四足動物的趾。在四足動物和魚類(包括斑馬魚)中對Hox基因表達(dá)和調(diào)控這些和其他模式?jīng)Q定因素進(jìn)行對比，將在未來揭示骨骼進(jìn)化和人類先天模式缺陷的更多方面。
四、骨化類型和骨細(xì)胞
在斑馬魚中，受精后3—4天，骨骼開始發(fā)育，并在2 - 4個月時逐漸形成成熟的骨骼(取決于斑馬魚的大小，表1)。許多元素通過膜內(nèi)和軟軟骨骨化形成，還有一些元素通過軟骨內(nèi)骨化形成(表1)。
斑馬魚骨骼根據(jù)解剖區(qū)域的不同，是由三種骨化類型中的一種形成的。膜內(nèi)骨化是斑馬魚骨骼骨化的主要形式，主要發(fā)生在顱頂、覆蓋鰓的鰓蓋和大部分椎骨等部位。軟骨內(nèi)骨化，即軟骨模板依次被骨取代，只產(chǎn)生包括1至5椎體神經(jīng)弓在內(nèi)的少數(shù)元素。軟軟骨骨化發(fā)生在軟骨表面而不取代軟骨模板，發(fā)生在斑馬魚下顎。雖然哺乳動物的椎骨*通過軟骨中間形成，但斑馬魚中心直接礦化從脊索鞘，脊索周圍的骨化層，然后膜內(nèi)骨形成。值得注意的是，脊索鞘也負(fù)責(zé)在中央形成之前斑馬魚脊柱的分割。
基于脊椎動物骨骼基因的進(jìn)化保守性，斑馬魚骨骼中含有與哺乳動物相同的骨細(xì)胞，即成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞(表1)。
與哺乳動物一樣，骨結(jié)合是由骨祖細(xì)胞衍生的成骨細(xì)胞完成的。在斑馬魚骨骼中，骨表面有很大一部分被成骨細(xì)胞覆蓋，成骨細(xì)胞的形態(tài)變化很大，并依賴于其位置和功能。在脊柱中，成骨細(xì)胞骨形成導(dǎo)致椎體前后方向體積和長度增加，從而拉長脊柱。在椎體間生長區(qū)域，特別是在圓形椎體終板上，可以很容易地評估這種骨形成(圖1B)。通過使用靜態(tài)組織形態(tài)測定法(靜態(tài)組織形態(tài)測定法通常應(yīng)用于嚙齒動物骨骼或人體活檢)，可以分析斑馬魚脊柱中的骨骼，包括每骨周長成骨細(xì)胞數(shù)量(N. Ob/B.Pm)、每骨表面類骨質(zhì)表面(OS/BS)和類骨質(zhì)厚度(O.Th)。
然而，斑馬魚骨也可以在連續(xù)的時間點用鈣黃素或素紅等熒光染料標(biāo)記，提供了進(jìn)行動態(tài)組織學(xué)形態(tài)測定的機(jī)會，并確定骨形成率(BFR)和骨礦物附著率(MAR)(表1)。在嚙齒類動物或人類模型中，染料是通過注射或攝入來使用的，而斑馬魚通常是通過將它們浸泡在染料溶液中來染色的。
斑馬魚的骨吸收是由單核和多核破骨細(xì)胞完成的。盡管單核破骨細(xì)胞存在于發(fā)育的早期階段，并且與淺層骨吸收模式有關(guān)，但多核破骨細(xì)胞會產(chǎn)生骨吸收陷窩，這在哺乳動物后來的破骨細(xì)胞中很常見。
哺乳動物骨骼建模和重塑的概念也適用于斑馬魚。骨造型被定義為通過骨形成和骨吸收來適應(yīng)不同表面載荷增加或減少的過程，而重塑則是在同一位置進(jìn)行，以維持骨基質(zhì)質(zhì)量和修復(fù)微裂紋。重塑，包括機(jī)械敏感骨細(xì)胞對破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的協(xié)調(diào)，以更新骨和修復(fù)微裂紋，在斑馬魚中不太明顯。骨基本上不存在。然而，斑馬魚的重塑過程被認(rèn)為是位點依賴性的，并與終生生長的需求有關(guān)。
斑馬魚的骨頭，與medakfish (Oryzias latipes，另一種硬骨魚)的骨頭相反，通常是骨細(xì)胞性的，盡管脊椎骨在幼年早期不包含骨細(xì)胞，而骨鰭射線和鱗片在整個生命過程中都保持骨細(xì)胞性。盡管哺乳動物骨細(xì)胞是重塑的主要協(xié)調(diào)者，但只有少數(shù)研究關(guān)注斑馬魚骨細(xì)胞腔隙網(wǎng)絡(luò)和樹突特征的機(jī)械感測能力。
然而，有證據(jù)表明在斑馬魚OI模型中骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)與骨形成之間存在關(guān)系，骨形成的改變與骨細(xì)胞陷窩數(shù)量的急劇減少有關(guān)。這些信息揭示了斑馬魚和哺乳動物骨骼生物學(xué)之間的一些重要差異，但也有許多共同之處(表1)。
五、斑馬魚的骨基質(zhì)和礦化
脊椎動物的骨是由一種主要含有I型膠原蛋白和非膠原蛋白的軟基質(zhì)組成，并通過磷酸鈣骨的摻入而變硬。
雖然不同脊椎動物骨骼的礦化程度不同，但哺乳動物和斑馬魚骨骼基質(zhì)的基本大分子和元素組成是保守的。用振動光譜學(xué)方法證明了斑馬魚骨中存在磷酸鹽、碳酸鹽、酰胺I和酰胺III、脯氨酸、羥脯氨酸和苯丙氨酸。這些分析顯示了嵌有碳酸鹽骨磷灰石的膠原基質(zhì)的典型指紋。
在魚骨生長過程中，無定形磷酸鈣被認(rèn)為在組織成熟過程中轉(zhuǎn)變?yōu)楦Y(jié)晶的礦物。除了鈣(Ca)和磷(P)，鎂也是儲存在斑馬魚骨頭中的主要礦物質(zhì)之一。此外，包括鍶和鋅在內(nèi)的微量元素參與了骨骼的形成，這與哺乳動物的情況類似。特別是，這些元素分別在scale和椎骨基質(zhì)中使用x射線熒光顯微鏡和能量色散x射線光譜學(xué)檢測到。
顯然，硬骨動物和陸生哺乳動物在礦物質(zhì)代謝方面存在一些差異。四足動物依賴膳食中磷和鈣的攝入來維持鈣磷基骨基質(zhì)，而斑馬魚生活在富含鈣的環(huán)境中，并通過鰓吸收鈣。然而，膳食中磷的攝入是必需的，通過基因控制或減少飲食來降低磷水平會導(dǎo)致非礦化基質(zhì)。
和哺乳動物一樣，斑馬魚骨骼基質(zhì)的組成和組織對于提供抗骨折能力至關(guān)重要。具體來說,相關(guān)的膠原蛋白和礦物質(zhì)和相關(guān)結(jié)構(gòu)屬性(膠原蛋白對齊、酶和非酶的交聯(lián),礦物粒子的大小和方向)和成分屬性(碳酸鹽磷酸鹽比),以及礦化的程度而言,整體骨礦物質(zhì)密度(BMD)或當(dāng)?shù)谻a內(nèi)容和分布,確定組織的機(jī)械性能水平。
這意味著整個骨骼水平的骨折風(fēng)險。從哺乳動物骨骼分析中借鑒了幾種技術(shù)來確定微米大小的斑馬魚骨骼的礦化程度(表1)?；诹u基磷灰石幻影校正的μ CT已被用于評估斑馬魚脊柱的骨密度。的確，突變導(dǎo)致的骨密度變化支持斑馬魚和哺乳動物模型中存在類似的礦化途徑。通過振動光譜學(xué)分析了攜帶col1a1突變的斑馬魚病理邏輯骨基質(zhì)的大分子組成，并證實了礦物-基質(zhì)和碳酸鹽-磷酸鹽比例的改變。
此外，可以使用振動光譜監(jiān)測截肢后再生的斑馬魚鰭骨的再礦化，從而比較新骨質(zhì)量和天然骨質(zhì)量(圖2A)。鈣含量和鈣在骨基質(zhì)中的分布是骨基質(zhì)礦化良好的另一個指標(biāo)。這些參數(shù)通常在嚙齒動物和人類活檢中使用二維(2D)反向散射電子顯微鏡(qBEI)進(jìn)行評估(圖2B)。近來，qBEI也被用于評價斑馬魚的脊椎，平均鈣含量增加8%與肌肉骨骼活動增加有關(guān)。
礦化的增加可能會增加骨骼的抗骨折性，盡管對斑馬魚骨骼(如單個椎骨)進(jìn)行全骨力學(xué)測試是具有挑戰(zhàn)性的(盡管可能)，因為它們的尺寸較小(VBL = 500 μ m)。納米壓痕技術(shù)是在組織水平上評估斑馬魚椎骨機(jī)械性能的有價值的工具。例如，衰老過程中，Ca/P比值的升高與斑馬魚脊椎彈性模量的增加有關(guān)，然而，也可以觀察到相反的效果。
在膠原紊亂和連續(xù)的礦物顆粒沉積的情況下，椎骨的彈性模量會降低，盡管礦化程度較高，這就強調(diào)了組織良好的基質(zhì)礦化對于抵抗骨折的重要性。值得注意的是，斑馬魚的骨基質(zhì)彈性模量值與哺乳動物相似(高達(dá)24 GPa)，突出了兩者在骨基質(zhì)組成和力學(xué)特性方面的相似性。這證實了使用斑馬魚是一個研究遺傳改變和外部刺激對骨基質(zhì)質(zhì)量影響的模型。
基質(zhì)礦化的問題，如磷酸酯內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂，已在斑馬魚中出現(xiàn)。磷酸鹽是骨中羥基磷灰石形成的必要礦物質(zhì)，其缺乏(低磷酸鹽血癥)是在突變體中引起的，在突變體中，磷酸鹽調(diào)節(jié)的必要基因發(fā)生改變。無骨(頭)突變體ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 5 (entpd5)基因受到影響(entpd5)，沒有礦化骨形成。在另一個突變體,dragonfish (dgf)，ectonucleotide pyrophosphatase 1 (enpp1)基因突變,導(dǎo)致焦磷酸鹽水平降低和軸骨和顱面骨骼的異位礦化。
dgf變異顯示改變與磷酸自我調(diào)節(jié)有關(guān)的基因的表達(dá)和骨礦化,如fgf23、溶質(zhì)載體家族34個成員1 (slc34a1a,也稱為npt2a) entpd5,分泌phospho-protein 1 (spp1),也可以被用來模型廣義動脈鈣化的嬰兒期(GACI)和彈性纖維假黃瘤 (PXE)。在雙突變體nob/dgf斑馬魚中觀察到恢復(fù)的骨骼礦化，表明Entpd5和Enpp1的相互調(diào)節(jié)。這說明了斑馬魚突變體分析和全新技術(shù)在理解脊椎動物礦化缺陷方面的有用性。
六、斑馬魚骨架對載荷的響應(yīng)
盡管斑馬魚骨骼的負(fù)重不同于陸生動物，但由于水的支持性浮力，骨骼確實會對機(jī)械載荷做出反應(yīng)(表1)。這來自于骨骼肌肉收縮的作用，以及在粘性介質(zhì)中游泳時產(chǎn)生的反作用力。

在胎兒早期，所有脊椎動物都是在水環(huán)境中發(fā)育的，無論是在子宮內(nèi)、卵中還是水中(表1)。在這段時間內(nèi)，肌肉對骨骼組織的作用引起了對骨骼發(fā)育的生物力學(xué)刺激。在小鼠、小雞和人類的實驗中已經(jīng)證實，胎兒運動的限制會導(dǎo)致礦化改變和關(guān)節(jié)突起形態(tài)形成的失敗。
在斑馬魚中，基因或藥理學(xué)誘導(dǎo)的麻痹導(dǎo)致軟骨細(xì)胞成熟改變，并通過改變軟骨細(xì)胞增殖和遷移導(dǎo)致異常關(guān)節(jié)形態(tài)發(fā)生。有限元(FE)建模的幼蟲顎，其中的結(jié)構(gòu)被細(xì)分為更小和更簡單的實體，允許建模的負(fù)荷影響組織變形，并已證明改變關(guān)節(jié)形狀影響生物力學(xué)應(yīng)變的模式。
關(guān)節(jié)的生物力學(xué)負(fù)荷是骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵危險因素。此外，像col11a2和prg4這樣表現(xiàn)出關(guān)節(jié)形狀改變的突變體會在這些關(guān)節(jié)中發(fā)展成骨關(guān)節(jié)炎。鑒于近來相關(guān)的識別位點與骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)的形狀改變?nèi)祟惏l(fā)生前癥狀和功能性篩選平臺形式的需要,這就提出了一個利用斑馬魚的前景篩選骨關(guān)節(jié)炎易感基因與聯(lián)合開發(fā)和維護(hù)(圖4)。

圖4所示  斑馬魚作為快速驗證gwas衍生的MS疾病相關(guān)候選基因的工具。(A)人類GWAS在大隊列上進(jìn)行WGS，并在異常MS表型的人群中識別SNP突變。然后利用全外顯子組測序?qū)np映射到近期的基因上。(B) CRISPR-Cas9技術(shù)可用于體內(nèi)靶向敲除誘變。設(shè)計基因特異性gRNAs，并將Cas9注入到單細(xì)胞階段的斑馬魚胚胎中。高效的gRNAs會促進(jìn)目標(biāo)基因外顯子內(nèi)的雙鏈斷裂，導(dǎo)致indel突變。一個花葉(G0)胚胎(crispant)將發(fā)育，包含各種突變和WT等位基因的興趣基因，并通過片段分析驗證。(C)(左)馬賽克斑馬魚幼蟲在骨骼發(fā)生過程中可以快速篩選MS表型，為基因驗證提供了一種高通量和高效的表型組學(xué)方法?；ㄈ~G0斑馬魚可以被飼養(yǎng)到成年，用一個已知的單一突變等位基因繁殖成一個穩(wěn)定的系。(右)G0花葉斑馬魚與WT雜交，導(dǎo)致雜合幼蟲(G1 +/−)夾鰭分離DNA進(jìn)行基因分型，并通過硅轉(zhuǎn)譯識別導(dǎo)致過早終止密碼子的等位基因，損害蛋白質(zhì)。具有相同突變等位基因的G1 +/−相互繁殖，產(chǎn)生具有穩(wěn)定突變的相關(guān)基因的G2−/−系。穩(wěn)定的突變體幼蟲或成蟲可用于MS相關(guān)表型的實驗驗證。gRNA =引導(dǎo)RNA;hpf =受精后的小時數(shù);女士=肌肉骨骼;單核苷酸多態(tài)性;全基因組測序;WT =野生型。
斑馬魚的脊柱和鰭的礦化比運動開始的時間要晚得多，在大約7 dpf (SL = 3.8 mm)時初次觀察到椎體的礦化，在第14天左右觀察到椎弓和鰭條(SL = 5 - 6 mm)。成年斑馬魚的骨骼肌生理負(fù)荷增加可觸發(fā)椎骨形成，這表明斑馬魚的骨骼易受Wolf定律的正向骨建模影響。斑馬魚每天在5-14 dpf范圍內(nèi)進(jìn)行9小時的游泳訓(xùn)練后，其尾部和脊柱出現(xiàn)過早骨化。
陸生物種中，骨細(xì)胞具有機(jī)械傳感器的功能，通過調(diào)節(jié)糖蛋白硬化蛋白(SOST)，指導(dǎo)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的重塑活動。然而，骨細(xì)胞魚也模仿骨頭對負(fù)荷的反應(yīng)。對骨細(xì)胞斑馬魚和骨細(xì)胞青鳉進(jìn)行游泳訓(xùn)練后，兩種魚的新骨形成模式驚人地相似，這是由軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在單個椎骨高應(yīng)變區(qū)域的sost表達(dá)介導(dǎo)的。有趣的是，斑馬魚的椎體運動分析和FE可以預(yù)測負(fù)重時骨衰竭的模式，這可以用于測試突變體的骨性能。
重力對陸生動物骨骼的負(fù)重起著重要作用，長時間暴露在微重力(失重或重力接近于零)下會導(dǎo)致人類骨密度下降。令人驚訝的是，重力也會影響硬骨魚的骨骼。利用國際空間站(ISS)上的一個水生生境進(jìn)行了幾項關(guān)于青鳉魚的研究。
這些研究表明，暴露在微重力環(huán)境下，青鳉會失去骨密度，骨骼基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，破骨細(xì)胞活性增加。雖然在國際空間站上沒有飼養(yǎng)過斑馬魚，但它們已經(jīng)暴露在越來越大的重力(超重力)下。在斑馬魚幼蟲發(fā)育過程中暴露于3g至9g可改變軟骨細(xì)胞成熟，并改變骨骼基因的礦化和轉(zhuǎn)錄。這些研究表明，斑馬魚模型在研究負(fù)重對骨骼的影響方面具有多功能性。
七、結(jié)論
斑馬魚在骨骼疾病和再生研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多，因為它們易于遺傳操作，方便的藥物治療選擇，以及在體內(nèi)成像的可能性。高通量的遺傳和藥物篩選可以在斑馬魚幼蟲中進(jìn)行，也可以用于異種移植受體研究骨轉(zhuǎn)移。哺乳動物和斑馬魚的生理機(jī)能有許多相似之處，這使得研究斑馬魚的激素性骨病成為可能。
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