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核心摘要  

在精準(zhǔn)腫瘤學(xué)中，預(yù)測臨床相關(guān)腫瘤疾病（如治療副反應(yīng)和耐藥性的出現(xiàn)）有兩種主要策略：基于患者樣本的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析的推斷，以及個(gè)性化癌癥化身的表型分析。長期以來，此類科研工作基本依賴于體內(nèi)小鼠異種移植和體外類器官構(gòu)建或細(xì)胞培養(yǎng)。
快速組合遺傳模型的進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，一種用先天免疫低下的斑馬魚研究人類腫瘤異種移植的新技術(shù)開發(fā)，以及*利用斑馬魚幼魚異種移植進(jìn)行藥物反應(yīng)表型檢測的臨床試驗(yàn)，使這種微小的脊椎動物走到了研究的前沿精準(zhǔn)醫(yī)療“競技場”。在這篇文章中，討論了轉(zhuǎn)基因和基于移植的斑馬魚癌癥模型如何與小鼠異種移植和人類類器官進(jìn)行比較和補(bǔ)充，并概述了這些不同模型為預(yù)測研究提供的*優(yōu)勢以及它們在未來臨床應(yīng)用中面臨的當(dāng)前挑戰(zhàn)。
文｜Maurizio Fazio , Julien Ablain, Yan Chuan, David M. Langenau  and Leonard I. Zon
翻譯丨張偉浩
文章原標(biāo)題：《Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy》
發(fā)表于《Nature Reviews |CANCER》volume 20 | May 2020 | 263
（本文在翻譯中做了部分節(jié)選）

一、斑馬魚和小鼠轉(zhuǎn)基因模型
不同的癌癥化身在生物學(xué)和邏輯上具有不同的優(yōu)勢和局限性，這使得它們的使用更適合于臨床前藥物開發(fā)或個(gè)性化藥物測試。在一般的轉(zhuǎn)基因癌癥模型中，限制其在精確腫瘤學(xué)中應(yīng)用的關(guān)鍵因素是模型構(gòu)建所需的時(shí)間和用于近似基因組癌癥復(fù)雜性的組合遺傳學(xué)的規(guī)模。關(guān)于斑馬魚、小鼠和類器官癌癥模型的比較，見下圖表1：

克隆和DNA合成方法的進(jìn)展表明，斑馬魚轉(zhuǎn)基因載體可以在1-2周內(nèi)產(chǎn)生。在斑馬魚體內(nèi)建立轉(zhuǎn)基因嵌合腫瘤模型所需的時(shí)間從10天到8周不等，比如人類KRAS G12D驅(qū)動的橫紋肌肉瘤，小鼠Myc驅(qū)動的T-ALL，NRAS Q61K驅(qū)動的黑色素瘤或黑色素瘤，源于成年BRAF V600E中靶向rb1（編碼視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1）的CRISPR載體的局部皮膚電穿孔tp53−斑馬魚。其他轉(zhuǎn)基因模型可能需要數(shù)月才能形成，例如肉瘤模型（例如，由CMV啟動子控制的PAX3–FOXO1易位驅(qū)動的橫紋肌肉瘤在19個(gè)月時(shí)有16%的外顯率）（圖2）。
圖2如下：

為了模擬基因組的復(fù)雜性，已經(jīng)成功地實(shí)現(xiàn)了三到四個(gè)基因組事件的組合，并有可能進(jìn)一步擴(kuò)大到10-20個(gè)改變，這取決于混合載體轉(zhuǎn)基因方法的局限性。從單個(gè)載體表達(dá)gRNAs陣列的策略可能進(jìn)一步擴(kuò)大CRISPR敲除策略的限制。
斑馬魚花葉病毒轉(zhuǎn)基因模型的組合遺傳學(xué)的速度和可擴(kuò)展性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了大多數(shù)基因工程小鼠模型，因?yàn)樗鼈儾恍枰M(jìn)行多代雜交。利用流體動力注射（肝癌）或病毒載體（肺癌）在體內(nèi)鑲嵌轉(zhuǎn)基因傳遞質(zhì)粒DNA的少量小鼠模型在腫瘤發(fā)病時(shí)間和組合遺傳學(xué)方面與斑馬魚模型具有相似的能力。
然而，小鼠維護(hù)、生物安全、病媒生產(chǎn)和處理方面的挑戰(zhàn)和成本，對產(chǎn)生足夠數(shù)量的動物來測試多種治療劑構(gòu)成了更大的障礙。相比之下，在生物安全級別1的條件下，一個(gè)操作員一天可以進(jìn)行幾千次斑馬魚胚胎顯微注射，只需使用皮克到納克的質(zhì)粒DNA就可以生成基因臨床患者的模型。
此外，飼養(yǎng)空間要求和成本雖然因國家和機(jī)構(gòu)而異，但斑馬魚至少比老鼠低一個(gè)數(shù)量級。
轉(zhuǎn)基因斑馬魚腫瘤模型目前仍然是有用的工具，用于基因型分層靶向治療的臨床前藥物開發(fā)，以及測序研究中確定的遺傳事件的表型解剖（例如，確定耐藥的遺傳驅(qū)動因素，基因作用的功能驗(yàn)證或克服抗性的新組合治療的鑒定）。
同樣重要的是要注意到，斑馬魚和小鼠轉(zhuǎn)基因模型的遺傳異質(zhì)性有限，通常不能重現(xiàn)在患者身上看到的致瘤事件的順序，并且對亞克隆結(jié)構(gòu)的建模能力有限。因此，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的建模仍然是一個(gè)主要的挑戰(zhàn)，并且仍然是這些模型預(yù)測患者藥物反應(yīng)的障礙。
二、PDXs和人類類器官：
使用病人來源的腫瘤材料進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性藥物試驗(yàn)的方法受到以下幾個(gè)因素的限制：
（1）在受體動物模型中體外培養(yǎng)或成功植入體內(nèi)病人來源的癌細(xì)胞的能力；
（2） 從活組織檢查或手術(shù)切除中獲得的可用于體外培養(yǎng)或體內(nèi)異種移植的有限數(shù)量的細(xì)胞；
（3）活組織檢查和分析讀數(shù)之間的時(shí)間；
（4）這些模型保持腫瘤異質(zhì)性和克隆進(jìn)化在患者體內(nèi)表現(xiàn)的保真度，以及腫瘤微環(huán)境和與患者免疫系統(tǒng)的協(xié)同進(jìn)化。
據(jù)報(bào)道，將患者來源的癌細(xì)胞異種移植到斑馬魚體內(nèi)在概念驗(yàn)證研究中取得了高度的成功，無論是在從特定患者成功建立zPDX方面，還是在受體斑馬魚中顯示出從特定供體植入的比例方面。
Fior等人在一項(xiàng)針對結(jié)直腸癌患者（n=5）的小型臨床研究中報(bào)告了100%的供體植入，其中47-89%的斑馬魚幼魚受體（n=47-251）顯示了植入。作為一項(xiàng)聯(lián)合臨床試驗(yàn)進(jìn)行的臨床研究的初步部分結(jié)果，包括24名胰腺癌（n=12）、結(jié)腸癌（n=8）或胃癌（n=4）的成年患者，同樣表明所有供體均植入，受體斑馬魚幼魚的存活率相當(dāng)。
其他研究報(bào)道在胃癌、腺樣囊性癌和胰腺癌的PDXs幼魚中成功植入。同樣，來自黑色素瘤（n=2）、癌（n=1）、膠質(zhì)瘤（n=1）或胚胎性橫紋肌肉瘤（n=2）患者的6個(gè)PDX在37°C下異種移植在prkdc−/−、il2rga−/−敲除的成年斑馬魚中。結(jié)果表明，所有6個(gè)供體的植入后有35–80%的受體動物移植成功。
其次，每個(gè)接受者使用的細(xì)胞數(shù)量既是一個(gè)限制，也是一個(gè)優(yōu)勢。病人的病理組織是有限的，而且常常是*的資源，尤其是來自活檢或小腫瘤切除的材料。因此，類器官或斑馬魚移植幼魚是有利的，因?yàn)樗恍枰s100個(gè)細(xì)胞每尾。因此，即使是少量的病人來源的細(xì)胞也可以有效地用于測試許多條件、藥物、給藥方案或藥物組合。另一方面，成年斑馬魚或小鼠的異種移植分別需要100000或100000–1000000個(gè)細(xì)胞。
第三，基于類器官的藥物檢測需要1-2周，幼魚體內(nèi)的zPDX需要4-7天，成年斑馬魚和小鼠的PDX需要數(shù)周甚至數(shù)月才能讀出。另一方面，成年斑馬魚和小鼠異種移植物中細(xì)胞數(shù)量較多，時(shí)間窗較長，這使得我們能夠觀察克隆進(jìn)化和適應(yīng)的影響過程，并對其進(jìn)行建模，這對下文進(jìn)一步討論的耐藥性預(yù)測具有意義。
一些基于移植的模型固有的局限性在老鼠和斑馬魚PDX之間很常見。小鼠研究強(qiáng)調(diào)了移植瓶頸和受體動物的進(jìn)化如何改變患者表現(xiàn)或?qū)е禄颊吆托∈竽Ｐ椭g不一致的進(jìn)化模式。Krivtsov及其同事在分析基因驅(qū)動等位基因頻率時(shí)報(bào)告了白血病小鼠PDX中50%的克隆不一致性，Golub及其同事展示了大量PDX在24種癌癥類型中的小鼠特異性腫瘤進(jìn)化。另一方面，在短期的體外培養(yǎng)過程中，人類類器官似乎保持了患者來源物質(zhì)的遺傳代表性。大規(guī)模的比較研究將需要確定遺傳和轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性在成年zPDX化身中隨時(shí)間而保留的程度。
雖然由于該領(lǐng)域的年輕化，臨床預(yù)測研究在頻率和規(guī)模上受到限制，但一些概念驗(yàn)證研究的結(jié)果令人鼓舞。菲奧埃特al.測試FOLFOX化療和西妥昔單抗對5種結(jié)直腸癌PDX在斑馬魚幼魚中的反應(yīng)。zPDXs與FOLFOX（5名患者中的4名）和西妥昔單抗（3名患者中的3名）的實(shí)際患者臨床反應(yīng)結(jié)果一致。
雖然這些數(shù)字顯然很小，但作為比較，迄今為止的一項(xiàng)關(guān)于人類類器官對治療反應(yīng)的預(yù)測價(jià)值的前瞻性臨床研究納入了61名結(jié)直腸癌患者，并報(bào)告從患者組織建立體外培養(yǎng)的成功率為63%，61例患者中只有29例（47%）有可評價(jià)的反應(yīng)，預(yù)測率為80%。因此，這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了藥物反應(yīng)的表型測試的前景和挑戰(zhàn)，即使是在比斑馬魚化身更成熟的技術(shù)中。
除了癌細(xì)胞固有的異質(zhì)性外，越來越多的證據(jù)表明，局部TME中存在的其他細(xì)胞類型在調(diào)節(jié)治療反應(yīng)中的重要性。與小鼠PDX非常相似，斑馬魚異種移植中局部TME成分的貢獻(xiàn)是有限的，基于移植的斑馬魚化身不能捕獲宿主-系統(tǒng)效應(yīng)，如免疫協(xié)同進(jìn)化和系統(tǒng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)（表1）。所有移植為基礎(chǔ)但更廣泛的患者來源腫瘤模型的這種結(jié)構(gòu)限制限制了所有這些分析在預(yù)測藥物敏感性方面的預(yù)測能力。
三、總結(jié)：
進(jìn)展表明類器官在模擬臨床腫瘤行為方面具有保真度，*報(bào)道類器官作為患者預(yù)后預(yù)測因子的前瞻性臨床試驗(yàn)為藥物應(yīng)答表型檢測的臨床價(jià)值提供了概念證明。
然而，同樣的前瞻性研究強(qiáng)調(diào)了這些體外工具的預(yù)測能力仍然很有限。同樣，自從2011年提出以來，由于后勤方面的挑戰(zhàn)，使用PDX的小鼠聯(lián)合臨床試驗(yàn)除了概念驗(yàn)證外幾乎沒有進(jìn)展。斑馬魚癌癥化身在規(guī)模、成本和模型開發(fā)速度以及自動化潛力方面比現(xiàn)有的活體模型具有*的優(yōu)勢。
就個(gè)性化的轉(zhuǎn)基因化身而言，時(shí)間障礙（測序、數(shù)據(jù)分析和載體生成的時(shí)間為1-4周，加上腫瘤潛伏期的時(shí)間為數(shù)周到數(shù)月）限制了它們?yōu)榕R床決策提供信息的益處。因此，它們?nèi)匀皇怯杏玫呐R床前模型，以解開癌癥遺傳學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)。
隨著成本的不斷降低，DNA測序和合成的速度和采用率的不斷提高，加上基因組工程技術(shù)的不斷改進(jìn)，應(yīng)該能夠產(chǎn)生更快速、更復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，用于分析個(gè)別患者可能的治療反應(yīng)。這些研究將有助于精確的癌癥醫(yī)學(xué)，既可以直接影響特定患者的模型，也可以增加我們對癌癥基因組學(xué)的更廣泛的理解。通過從功能上評估特定突變對藥物反應(yīng)調(diào)節(jié)的影響，他們還應(yīng)該提高我們根據(jù)推斷模型來制定反應(yīng)預(yù)測的能力，分析從不同類型的組學(xué)分析中觀察到的腫瘤活檢樣本的變化。
另一方面，現(xiàn)在斑馬魚異種移植細(xì)胞的技術(shù)已經(jīng)成熟，并且已經(jīng)為幼魚和成魚zPDX的產(chǎn)生提供了強(qiáng)有力的概念驗(yàn)證研究，因此該領(lǐng)域走向臨床部署并進(jìn)行臨床研究以評估其預(yù)測能力和價(jià)值至關(guān)重要為臨床決策提供信息。
正在進(jìn)行的試驗(yàn)旨在招募120名癌癥患者，以評估幼魚zPDXs的預(yù)測能力，這是一個(gè)很好的例子，并將為幼魚zPDXs的整體價(jià)值提供有用的見解。目前還不清楚是否zPDXs在幼魚中可以提供顯著的優(yōu)勢相比，人類的類器官和頭部研究將需要解決這個(gè)問題。這些幼魚模型在以快速和短期反應(yīng)為目標(biāo)的臨床環(huán)境中可能有價(jià)值，例如術(shù)前新輔助化療。
除了藥物反應(yīng)預(yù)測之外，已經(jīng)提出了用斑馬魚PDXs評估幼魚的轉(zhuǎn)移行為，但是還需要進(jìn)一步的研究來評估發(fā)育中胚胎的遷移是否對人類癌癥的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)或器官傾向性有幫助。
有證據(jù)表明，小鼠PDX和成年zPDX在生物學(xué)和預(yù)測方面具有相當(dāng)?shù)牡刃?，再加上斑馬魚模型較低的成本以及較高的藥物篩選效率，將使其成為精確癌癥治療的有吸引力的替代品（表1）。
成本效益分析將指導(dǎo)表型藥物檢測多個(gè)領(lǐng)域的參與者在臨床上取得進(jìn)展。在生存結(jié)果和避免毒性反應(yīng)方面對患者的潛在臨床益處，同時(shí)能夠避免無效治療的浪費(fèi)和控制管理的潛在風(fēng)險(xiǎn)和成本節(jié)約，是進(jìn)一步開發(fā)個(gè)性化癌癥模型的必然需求。
參考資料：
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