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核心摘要  
越來(lái)越多的證據(jù)表明腸道微生物組可能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程和行為產(chǎn)生影響。在這項(xiàng)研究中，我們使用新型水箱試驗(yàn)（NTT）來(lái)分析斑馬魚(yú)在補(bǔ)充具有探測(cè)到的抗氧化劑和抗炎特性的益生菌4個(gè)月后的探索行為。結(jié)果表明，長(zhǎng)期攝入鼠李糖乳桿菌CECT8361和長(zhǎng)雙歧桿菌CECT7347會(huì)明顯改變斑馬魚(yú)模型的游泳方式和平均游泳速度。經(jīng)過(guò)處理后，斑馬魚(yú)放到新的水箱中后，降低了其缸底行為，這可能與焦慮程度較低有關(guān)。
文｜大衛(wèi)·G·瓦爾卡塞，胡安·M. ·馬丁內(nèi)斯-巴斯克斯，Marta F. Riesco，Vanesa Robles
文章發(fā)表于《Heliyon》 6（2020）e03973

一、綜述
益生菌的使用不斷增加，拓寬了我們對(duì)腸道微生物組和細(xì)菌代謝物的組成通過(guò)不同的調(diào)節(jié)途徑對(duì)神經(jīng)和行為過(guò)程的相關(guān)影響的認(rèn)識(shí)。近年來(lái)，大多數(shù)研究都集中在人類(lèi)或其他哺乳動(dòng)物上，然而，使用斑馬魚(yú)模式生物已比較常見(jiàn)。這是因?yàn)?，它們很容易人工飼養(yǎng)繁殖，并且它們的一些神經(jīng)通路與哺乳動(dòng)物的神經(jīng)通路具有高度同源性。
斑馬魚(yú)（Danio rerio）作為一種模式生物，其益生菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以用作人類(lèi)治療的參考，因?yàn)樗鼈兙哂邢嗨频哪c道微生物群和定殖模式。新型水箱試驗(yàn)（NTT），是用來(lái)測(cè)試斑馬魚(yú)焦慮相關(guān)行為的泛使用的實(shí)驗(yàn)程序之一，這是基于它們自然的偏好，即*將其放置在新型水箱中時(shí)會(huì)在底部附近游泳。人們通常認(rèn)為魚(yú)離開(kāi)魚(yú)缸底部并開(kāi)始探索其他區(qū)域之前，斑馬魚(yú)所花費(fèi)的時(shí)間差異反映了它們所經(jīng)歷的焦慮。多項(xiàng)研究使用這種方法分析了不同物質(zhì)對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的影響，觀察到與地西epa，丁螺環(huán)酮等抗焦慮藥和氟西汀等呈正相關(guān)。然而，尚未深入研究益生菌攝入對(duì)行為反應(yīng)的附帶影響，在某些情況下對(duì)壓力的反應(yīng)有所降低，而在其他情況下則沒(méi)有直接的相關(guān)性。因此，觸發(fā)此響應(yīng)的機(jī)制仍不清楚。
在本研究中，我們分析了給予鼠李糖乳桿菌CECT8361和長(zhǎng)雙歧桿菌CECT7347菌株的益生菌混合物（1：1）的斑馬魚(yú)成魚(yú)的探索行為如何受到影響，這已經(jīng)證明它們對(duì)改善人類(lèi)和斑馬魚(yú)的生精性能方面的作用。
二、實(shí)驗(yàn)方法及新型水箱測(cè)試：
這項(xiàng)研究使用了兩組成年野生斑馬魚(yú)（AB品系）。將所有魚(yú)飼養(yǎng)在3升的水箱中，并從配備有機(jī)械、化學(xué)和生物過(guò)濾器的再循環(huán)系統(tǒng)交換恒定的水。將水保持在26°C的平均溫度，房間以14/10的明暗周期進(jìn)行。
為了評(píng)估益生菌施用對(duì)魚(yú)類(lèi)行為的影響，為每個(gè)組提供了4個(gè)月（2018年12月至2019年3月）的不同喂養(yǎng)方式。在行為測(cè)試前一個(gè)月，將每只魚(yú)在110 mg / L的三卡因甲磺酸緩沖液（MS222）中進(jìn)行麻醉，并分別用可見(jiàn)的植入彈性體進(jìn)行標(biāo)記（Northwest Marine Technology，WA，USA）。在實(shí)驗(yàn)期間，CTRL的一條魚(yú)死亡。
將四邊形玻璃水族箱（20×8×18 cm；長(zhǎng)×寬×深）填充至總體積為3.5 L，并將其用作評(píng)估場(chǎng)所。使用網(wǎng)將每條魚(yú)分別放置在水箱底部，并記錄其游泳行為（1920×1080 px），持續(xù)6分鐘。試驗(yàn)結(jié)束后，將魚(yú)與不同組的幼稚魚(yú)分開(kāi)轉(zhuǎn)移到回收池中。使用NoldusEthovision®跟蹤軟件分析了視頻文件，生成了一個(gè)虛擬網(wǎng)格，將儲(chǔ)罐在上下區(qū)域的一半深度處分開(kāi)。確定每個(gè)區(qū)域所花費(fèi)的時(shí)間（以占總時(shí)間的百分比表示），區(qū)域之間的穿越次數(shù)、平均速度、移動(dòng)的總距離以及穿越上方區(qū)域的等待時(shí)間。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
當(dāng)將魚(yú)放置在新的環(huán)境中時(shí)，其本能會(huì)在水柱底部引發(fā)保護(hù)性潛水行為，從而降低了被更接近水面的潛在捕食者襲擊的風(fēng)險(xiǎn)。
新型水箱試驗(yàn)（NTT）是基于此響應(yīng)在斑馬魚(yú)行為實(shí)驗(yàn)中常用的測(cè)試。該測(cè)定法可以被定義為嚙齒動(dòng)物開(kāi)放視野范例的類(lèi)似物。因此，由于NTT在“安全”潛水行為與“探索”游泳行為之間存在沖突，因此可以研究在特定實(shí)驗(yàn)條件下魚(yú)的趨地逃逸潛水本能的強(qiáng)度。
在正常受控的實(shí)驗(yàn)室條件下，斑馬魚(yú)通常在監(jiān)測(cè)的前幾分鐘傾向于在水箱底部花費(fèi)更多的時(shí)間，顯示出較高的不穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)和不動(dòng)事件發(fā)生率。適應(yīng)期過(guò)后，斑馬魚(yú)逐漸探索水柱的上部。我們的結(jié)果表明，成年斑馬魚(yú)以抗氧化劑和抗炎混合物的益生菌菌株為食（圖1A）持續(xù)四個(gè)月，與對(duì)照喂養(yǎng)的魚(yú)相比，表現(xiàn)出強(qiáng)烈改變的行為模式。
使用Ethovision軟件，我們創(chuàng)建了兩個(gè)同構(gòu)的虛擬子區(qū)域（圖1 B），目的是分析探索模式（行為的時(shí)空動(dòng)態(tài)）。
我們的結(jié)果顯示，在新型水箱測(cè)試中，虛擬產(chǎn)生的游泳區(qū)域（上下）的偏好性有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（p = 0.0137；t = 2.790）。益生菌喂養(yǎng)的動(dòng)物在分析熱圖時(shí)表現(xiàn)出對(duì)上部區(qū)域的總體強(qiáng)烈偏好（圖 1）。C和1D）。

圖1  鼠李糖乳桿菌CECT8361和長(zhǎng)雙歧桿菌CECT7347的攝入可調(diào)節(jié)4個(gè)月后斑馬魚(yú)的行為。（一）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。（B）新型水箱試驗(yàn)（NTT）和已建立的分析區(qū)域的示意圖。（C）在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組（CONTROL和PROBIO）的軌跡進(jìn)行Ethovision分析后獲得的熱圖。
另一方面，標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)的動(dòng)物對(duì)表面沒(méi)有這種偏愛(ài)。實(shí)際上，與CTRL記錄的平均值（40±13.2％）相比，PROBIO組在較高區(qū)域中獲得的時(shí)間百分比的平均值（80±6.5％）。在對(duì)照組中，只有50％的受研究魚(yú)類(lèi)表現(xiàn)出對(duì)上部區(qū)域的偏愛(ài)，而88.89％的益生菌喂養(yǎng)的動(dòng)物更喜歡靠近水面。實(shí)際上，PROBIO組中的9條魚(yú)中有7條在上分區(qū)花費(fèi)了80％的6分鐘新穎水箱測(cè)試實(shí)驗(yàn)。
我們還評(píng)估了速度，每只動(dòng)物的總游走距離（圖1 E），分區(qū)之間的過(guò)渡次數(shù)（圖1 F）和穿越的潛伏期（圖1）。G）。統(tǒng)計(jì)分析僅記錄了平均速度（圖1 E）的顯著差異（p = 0.0158；t = 2.719 ）。
在我們的實(shí)驗(yàn)中，與益生菌喂養(yǎng)的魚(yú)兄弟姐妹（4.2±0.3 cm / s）相比，CTRL顯示出更高的速度（6±0.5 cm / s）。進(jìn)入PROBIO組的上部分區(qū)的潛伏期令人驚訝地低（直到探索上部區(qū)域，沒(méi)有一條魚(yú)持續(xù)超過(guò)10 s）（圖1 H）。

圖1  鼠李糖乳桿菌CECT8361和長(zhǎng)雙歧桿菌CECT7347的攝入可調(diào)節(jié)4個(gè)月后斑馬魚(yú)的行為。柱狀圖和點(diǎn)狀圖顯示：（D）動(dòng)物在上部區(qū)域所花費(fèi)的時(shí)間（％）；（E）平均速度（cm / s）; （F）總距離（厘米）；（G）過(guò)線(xiàn)點(diǎn)（n。）和（H）到過(guò)境點(diǎn)的延遲時(shí)間。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。星號(hào)顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異*（p <0.050）。
這些數(shù)據(jù)令人關(guān)注，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合了明確的空間偏好；它們表明群體之間的行為模式存在明顯差異。壓力可以調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)的NTT模式行為。一些通常用于治療人類(lèi)焦慮癥的抗焦慮藥，例如丁螺環(huán)酮和地西epa或慢性氟西汀，往往會(huì)增加斑馬魚(yú)在實(shí)驗(yàn)設(shè)備頂部花費(fèi)的時(shí)間。
這些與我們的結(jié)果的相似性表明，益生菌混合物可能對(duì)模型動(dòng)物的焦慮調(diào)節(jié)有影響。進(jìn)一步的研究可以解決抗焦慮控制的納入和菌株定植的證明。但是，我們認(rèn)為在4個(gè)月內(nèi)持續(xù)進(jìn)食可以確保腸道中細(xì)菌及其代謝物的持續(xù)存在。
總之，我們已經(jīng)確定，鼠李糖乳桿菌CECT8361和長(zhǎng)雙歧桿菌CECT7347的長(zhǎng)期攝入（4個(gè)月）會(huì)改變斑馬魚(yú)模型中的游泳方式。我們的研究結(jié)果表明，成年斑馬魚(yú)飼喂這種已批準(zhǔn)供人類(lèi)食用的抗氧化劑和消炎益生菌菌株的益生菌混合物，可將其放置在新的水箱中，從而大大降低斑馬魚(yú)的底棲測(cè)地行為。這種主要的行為反應(yīng)與較低的焦慮狀態(tài)相關(guān)。因此，攝入這種益生菌混合物可以被認(rèn)為是治療焦慮癥的有益方法。