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核心摘要  
探究二十五味肺病丸抗細(xì)顆粒物( PM2.5 ) 的作用機(jī)制。
方法: 水溶給予不同濃度二十五味肺病丸( 62.5,125,250,500 和1000 μg·mL) 干預(yù)，篩選斑馬魚(yú)對(duì)二十五味肺病丸的耐受濃度。實(shí)驗(yàn)中使用納米活性炭顆粒模擬 PM2.5 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，靜脈注射( iv) 納米活性炭建立斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬 PM2.5 功能模型; 肌內(nèi)注射納米活性炭建立斑馬魚(yú) PM2.5 分泌進(jìn)入腸道功能評(píng)價(jià)模型; 水溶給予尼羅紅建立斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)評(píng)價(jià)模型。二十五味肺病丸干預(yù)后，統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)體內(nèi)吞噬納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量、巨噬細(xì)胞吞噬促進(jìn)率以及納米活性炭分泌進(jìn)入腸道的數(shù)量，并進(jìn)一步探究二十五味肺病丸對(duì)斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)功能的影響。選取轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚(yú)，卵黃囊注射脂多糖建立斑馬魚(yú)炎癥模型，觀察并統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)，以炎癥消退率評(píng)價(jià)二十五味肺病丸的抗炎癥作用。
結(jié)果: 二十五味肺病丸對(duì)斑馬魚(yú)的給藥濃度為 125 μg·mL ; 二十五味肺病丸可以促進(jìn)斑馬魚(yú)體內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì) PM 的吞噬，并促進(jìn) PM 分泌進(jìn)入腸道，加快腸蠕動(dòng)，減少斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。
結(jié)論: 二十五味肺病丸具有顯著的抗PM2.5 作用，其作用可能與其促進(jìn)機(jī)體 PM2. 5 的清除及抗炎作用有關(guān)。
文｜陳維武 ，周生軍，黃燕烽，次旺久美，彭逸 ，陳倫舉（西藏奇正藏藥股份有限公司，杭州環(huán)特生物科技股份有限公司）
國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目( 2017ZX09031059)
文章發(fā)表于《中國(guó)新藥雜志》 2019 年第28卷第22期

一、綜述
大氣污染是目前危害人類(lèi)健康的重要危險(xiǎn)因素。細(xì)顆粒物( PM2.5) 是指環(huán)境中空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5 μm 的顆粒物，其表面可以富集大量的重金屬、病毒、細(xì)菌、酸性氧化物等有毒物質(zhì)，可通過(guò)機(jī)體的呼吸系統(tǒng)吸入肺泡和血液中。
流行病學(xué)研究表明，PM2.5顆粒污染與心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生率密切相關(guān)。人暴露在 PM2.5顆粒過(guò)量的環(huán)境中，可增加機(jī)體的氧化應(yīng)激水平和肺部的慢性炎癥反應(yīng)，增加哮喘、肺癌及動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)存在多種途徑清除侵入體內(nèi)的 PM2.5，包括吞噬細(xì)胞的吞噬以及黏液-纖毛系統(tǒng)的清除等; 但侵入機(jī)體的 PM2.5過(guò)量或PM2.5代謝清除異常時(shí)，機(jī)體內(nèi)蓄積的PM2.5會(huì)進(jìn)入血液系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)對(duì)全身健康產(chǎn)生影響。
由于PM2.5超細(xì)顆粒物的成分和粒徑復(fù)雜，收集大氣中的超細(xì)顆粒進(jìn)行研究較為困難，因此研究者多采用納米活性炭顆粒代替PM2.5超細(xì)顆粒物進(jìn)行研究。
二十五味肺病丸始載于《四部醫(yī)典》， 全方由紅花、檀香、獐牙菜、懸鉤木、牛黃、沙棘膏、訶子等25 味藥材組成，是傳統(tǒng)藏藥理論與現(xiàn)代制藥技術(shù)相結(jié)合研發(fā)出的新型藏藥，對(duì)外邪引起的肺 熱、肺結(jié)核、肺 炎、呼吸急促等熱性肺病療效明顯。
目前，對(duì)于二十五味肺病丸的研究主要集中在對(duì)肺部疾病的治療作用，而對(duì)于防治PM2.5對(duì)機(jī)體的損害作者尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)使用斑馬魚(yú)誘導(dǎo)多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，納米活性炭模擬 PM2.5顆粒物，水溶性給予二十五味肺病丸干預(yù)，探究二十味肺病丸的抗 PM2.5作用。
二、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c方法：
1. 巨噬細(xì)胞吞噬功能評(píng)價(jià)模型
隨機(jī)選取 120 尾黑色素等位基因突變型 Albino品系斑馬魚(yú)，靜脈注射( iv) 給予納米活性炭建立斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能評(píng)價(jià)模型。水溶給予二十五味肺病丸處理 2 d 后，加入中性紅溶液對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行活體染色，染色結(jié)束后統(tǒng)計(jì)吞噬了納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量( N) ，以巨噬細(xì)胞吞噬促進(jìn)率來(lái)評(píng)價(jià)二十五味肺病丸對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。
2. 腸道功能改善評(píng)價(jià)模型
隨機(jī)選取 120 尾黑色素等位基因突變型 Albino品系斑馬魚(yú)，肌內(nèi)注射( im)  給予納米活性炭建立斑馬魚(yú)納米活性炭分泌進(jìn)入腸道功能評(píng)價(jià)模型，水溶給予二十五味肺病丸處理 5 d 后，統(tǒng)計(jì)體內(nèi)納米活性炭分泌進(jìn)入腸道的斑馬魚(yú)數(shù)量( Z) ，評(píng)價(jià)二十五味肺病丸對(duì)納米活性炭分泌進(jìn)入腸道功能的影響。
3. 腸道蠕動(dòng)功能評(píng)價(jià)模型
隨機(jī)選取 120 尾野生型 AB 品系斑馬魚(yú)，水溶給予尼羅紅 16 h 建立斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)評(píng)價(jià)模型。水溶給予二十五味肺病丸處理 6 h 后，每組隨機(jī)取 10 尾斑馬魚(yú)在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)腸腔中熒光染料信號(hào)強(qiáng)度、拍照并保存圖片，用尼康 NIS-Elements D 3． 10 高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算斑馬魚(yú)腸腔熒光染料信號(hào)強(qiáng)度( S) 進(jìn)行定量分析，評(píng)價(jià)二十五味肺病丸促進(jìn)腸道蠕動(dòng)功能。
4. 斑馬魚(yú)炎癥消退模型
隨機(jī)選取 120 尾轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚(yú)，分別水溶給予二十五味肺病丸和陽(yáng)性對(duì)照藥吲哚美辛。藥物處理 1 h 后，卵黃囊注射脂多糖建立斑馬魚(yú)炎癥模型，然后再分別水溶給予二十五味肺病丸和陽(yáng)性對(duì)照藥吲哚美辛干預(yù)。藥物再處理 2 h 后，分別統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)( N) ， 以炎癥消退率來(lái)評(píng)價(jià)二十五味肺病丸的抗炎癥作用。
藥物濃度與模型數(shù)量: 二十五味肺病丸濃度為13.9，41.7 和 125 μg·mL，吲哚美辛 60 μmol·L，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，每孔( 實(shí)驗(yàn)組) 均處理 30 尾斑馬魚(yú)，每孔容量為 3 mL。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1. 確定斑馬魚(yú)對(duì)二十五味肺病丸的耐受濃度
二十五味肺病丸 62.5，125 和 250 μg·mL 濃度組斑馬魚(yú)均未出現(xiàn)死亡，但 250 μg·mL濃度組斑馬魚(yú)出現(xiàn)側(cè)翻，且 500 和 1 000 μg·mL濃度組斑馬魚(yú)全部死亡。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定二十五味肺病丸對(duì)斑馬魚(yú)的給藥濃度為 125 μg·mL( 見(jiàn) 表 1) 。

表 1  二十五味肺病丸“濃度-死亡率”原始數(shù)據(jù)
2. 二十五味肺病丸促進(jìn)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞的吞噬作用
與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組斑馬魚(yú)吞噬納米活性炭顆粒個(gè)數(shù)為 16 個(gè)，提示斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能評(píng)價(jià)模型造模成功。
二十五味肺病丸濃度為 13.9，41.7 和 125 μg·mL時(shí)，斑馬魚(yú)吞噬了納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量分別為 36，30 和 25個(gè)，與模型對(duì)照組( 16 個(gè)) 比較 P 均 ＜ 0.001，其對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬促進(jìn)率分別為 125.0% ，87.5%和 56.3% ，提示二十五味肺病丸在 13.9，41.7 和 125 μg·mL濃度時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能都有明顯的促進(jìn)作用( 見(jiàn)圖 1 和表 2) 。

圖 1   二十五味肺病丸各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)腦部巨噬細(xì)胞吞噬納米活性炭表型圖
         黑色區(qū)域: 斑馬魚(yú)腦部巨噬細(xì)胞統(tǒng)計(jì)區(qū)域; 黃色箭頭: 吞噬了納米活性炭的巨噬細(xì)胞， 由于其吞噬了納米活性炭，顏色比正常的巨噬細(xì)胞要深。

表 2   二十五味肺病丸對(duì)各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
3. 二十五味肺病丸促進(jìn)納米活性炭分泌進(jìn)入腸道
與正常對(duì)照組( 未見(jiàn)納米活性炭顆粒) 相比，納米活性炭分泌發(fā)生率為 23. 3% ，提示腸道功能改善評(píng)價(jià)模型造模成功。二十五味肺病丸濃度為13.9和 41.7 μg·mL時(shí)，納米活性炭分泌發(fā)生率分別為26. 7% 和 36. 7%,與模型對(duì)照組(23. 3%) 比較 P 均＞0. 05,提示二十五味肺病丸在 13. 9 和 41. 7 μg· mL濃度時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)納米活性炭分泌進(jìn)入腸道沒(méi)有促進(jìn)作用。
二十五味肺病丸濃度為 125 μg·mL時(shí)，納米活性炭分泌發(fā)生率為 56. 7%,與模型對(duì)照組( 23. 3%) 比較P＜0.01,提示二十五味肺病丸在 125 μg·mL濃度時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)納米活性炭分泌進(jìn)入腸道有明顯的促進(jìn)作用( 見(jiàn)圖 2 和表 3) 。

圖 2  二十五味肺病丸各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)腸道分泌納米活性炭表型圖
        紅色范圍: 斑馬魚(yú)腸道; 藍(lán)色箭頭: 腸道外的納米活性炭; 黃色箭頭: 腸道內(nèi)的納米活性炭

4. 二十五味肺病丸促進(jìn)斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)
水溶給予尼羅紅染料 16 h 后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組斑馬魚(yú)腸腔有紅色熒光分布，提示斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)評(píng)價(jià)模型造模成功。
二十五味肺病丸在濃度為 13.9，41.7 和 125 μg·mL時(shí)，斑馬魚(yú)腸腔熒光強(qiáng)度分別為 641 473，625 366 和 616 768 像素，其腸蠕動(dòng)促進(jìn)率分別為 17.4% ，19.4% 和 20.6% ，與模型對(duì)照組( 776 340 像素)  比較，13.9 和 41.7 μg· mL濃度組  P ＜ 0.05，125 μg·mL 濃度組  P＜0. 01，提示二十五味肺病丸對(duì)斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)有促進(jìn)作用( 見(jiàn)圖 3、圖 4 和表 4) 。

圖4  二十五味肺病丸各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)表型圖

表4  二十五味肺病丸對(duì)各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)的影響
5.  二十五味肺病丸減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
與正常對(duì)照組( 3.6 個(gè))  比較，模型對(duì)照組斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)為 21.7 個(gè)，提示斑馬魚(yú)炎癥消退模型建立成功。
陽(yáng)性對(duì)照藥吲哚美辛 60 μmol·L濃度組斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)為 14.2 個(gè)，與模型對(duì)照組比較 P＜ 0.05，提示吲哚美辛具有抗炎癥作用，其炎癥消退率為34.6%。
二十五味肺病丸濃度為 13.9 和 41.7 μg·mL時(shí)，斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量分別為 19.1 和 19.0個(gè)，與模型對(duì)照組( 21.7 個(gè))  比較 P 均 ＞ 0.05，其對(duì)斑馬魚(yú)炎癥消退率分別為12.0%和12.4%,提示二十五味肺病丸在 13.9 和 41.7 μg·mL濃度時(shí)對(duì)脂多糖誘發(fā)的炎癥沒(méi)有抗炎癥作用。二十五味肺病丸濃度為 125 μg·mL時(shí)，斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量分別為 15.0 個(gè)，與模型對(duì)照組( 21.7 個(gè)) 比較P＜0.05，其對(duì)斑馬魚(yú)炎癥消退率為 30.9% ，提示二十五味肺病丸在 125 μg·mL濃度時(shí)可以減輕脂多糖誘發(fā)的炎癥( 見(jiàn)表 5 和圖 5) 。

表 5二十五味肺病丸對(duì)斑馬魚(yú)脂多糖誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的影響

圖5  二十五味肺病丸各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況
       黃色區(qū)域: 斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)中性粒細(xì)胞統(tǒng)計(jì)區(qū)域
四、討論
隨著大氣污染的加劇，PM2.5 已經(jīng)成為影響人類(lèi)健康的一大殺手。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，PM2.5 與肺癌、心血管疾病、衰老等疾病的發(fā)病率密切相關(guān)。PM2.5顆?？諝鈩?dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm，吸入機(jī)體后代謝周期長(zhǎng)，并能通過(guò)外周循環(huán)進(jìn)入各組織器官。PM2.5能增加機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，引發(fā)級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)。盡管 PM2.5引發(fā)的健康問(wèn)題形勢(shì)嚴(yán)峻，但目前臨床上還未有以干預(yù) PM2.5為靶點(diǎn)的治療藥物。
二十五味肺病丸是藏醫(yī)古典巨著《四部醫(yī)典》中的經(jīng)典名方，隨著近年來(lái)科技的進(jìn)步，越來(lái)越多的研究者把目光集中在中國(guó)傳統(tǒng)藏藥名方上。二十五味肺病丸作為臨床肺部疾病治療的一線(xiàn)用藥， 對(duì)肺炎、肺水腫、肺結(jié)核的治療療效顯著。如果將二十五味肺病丸用于干預(yù) PM2.5 對(duì)機(jī)體的侵害， “老藥新用”將縮短研發(fā)時(shí)間，有可能為臨床用藥提供一個(gè)安全、可靠的治療方案。
斑馬魚(yú)與人類(lèi)基因同源性高達(dá) 87% ，生物功能和結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物高度相似，具有發(fā)育周期短、個(gè)頭小、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，因此實(shí)驗(yàn)中我們選用斑馬魚(yú)作為動(dòng)物模型。肺泡巨噬細(xì)胞主要分布于呼吸道和肺泡表面，是肺部抵御外界污染的屏障，可以吞噬外來(lái)的顆粒物和細(xì)菌，并通過(guò)胞內(nèi)的溶酶體將其清除，是機(jī)體代謝  PM2.5的主要途徑之一。
在篩選出斑馬魚(yú)對(duì)二十五味肺病丸的耐受濃度之后，以納米活性炭模擬 PM2.5 顆粒，我們發(fā)現(xiàn)二十五味肺病丸在 13.9，41. 7 和 125 μg·mL濃度時(shí)均能增加斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。
巨噬細(xì)胞在識(shí)別到 PM2.5 顆粒后，會(huì)攝入質(zhì)膜形成吞噬體，吞噬體與溶酶體結(jié)合形成吞噬溶酶體，在溶酶體內(nèi)的多種水解酶消化分解作用下，PM2.5 顆粒被吸收在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。二十五味肺病丸可能通過(guò)增加巨噬細(xì)胞的吞噬作用，促進(jìn)機(jī)體對(duì) PM2.5 顆粒的清除。
吞噬細(xì)胞表面存在多種受體可介導(dǎo)其吞噬作用 及胞吞物的專(zhuān)一性，二十五味肺病丸通過(guò)何種受體介導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì) PM2.5 顆粒的吞噬是我們下一步研究的重點(diǎn)。腸道是 PM2.5 顆粒物代謝的另一代謝途徑之一，PM2.5 的攝入會(huì)引起小腸上皮細(xì)胞功能紊亂，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的募集， 釋放大量細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(  tumor nec-rosis factor-α，TNF-α ) 、白介素 1β (  interleukin-1 β， IL-1β)  等，損傷腸道結(jié)構(gòu)、影響腸道功能。腸蠕動(dòng)功能是消化道主要的功能之一，改善腸蠕動(dòng)功 能，可以增加消化道的消化吸收能力，促進(jìn)消化液的分泌。
我們發(fā)現(xiàn)二十五味肺病丸在 125 μg· mL濃度時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)納米活性炭分泌進(jìn)入腸道有明顯的促進(jìn)作用，13.9，41.7 和 125 μg·mL3個(gè)濃度時(shí)均能改善斑馬魚(yú)的腸道功能，促進(jìn)斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)，增加 PM2.5的外排，進(jìn)一步提示二十五味肺病丸可以加速機(jī)體代謝 PM2.5 的作用。

PM2.5 除了可以引發(fā)肺部的炎癥反應(yīng)外，還可以通過(guò)募集免疫細(xì)胞影響其他組織器官的炎癥水平。
脂多糖誘導(dǎo)是模擬炎癥反應(yīng)發(fā)生的經(jīng)典模型，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，二十五味肺病丸濃度為 125 μg·mL時(shí)，斑馬魚(yú)卵黃囊內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量分別為 15.0 個(gè)，與模型對(duì)照組 ( 21.7 個(gè))  比較  P＜ 0.05，提示二十五味肺病丸在 125 μg·mL濃度時(shí)對(duì)脂多糖誘發(fā)的炎癥有抗炎癥作用。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二十五味肺病丸在 125μg·mL濃度時(shí)能促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì) PM2.5的吞噬清除，加速其分泌到腸道，改善腸道功能、促進(jìn)其外排。與此同時(shí)減少 PM2.5誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞的募集和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，減少 PM2.5 對(duì)機(jī)體的損害。
二十五味肺病丸作為臨床一線(xiàn)用藥，主要治療肺病引起的咳嗽、胸脅痛、發(fā)燒等，目前針對(duì)其抗PM2.5 的研究相對(duì)較少。如何將該藥已有的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)與新適應(yīng)證研究相結(jié)合是下一步研究方向。本實(shí)驗(yàn)中二十五味肺 病丸的藥效學(xué)評(píng)價(jià)主要在斑馬魚(yú)模型上完成，存在一定的局限性，未來(lái)還需要在哺乳動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中對(duì)療效和安全性做進(jìn)一步驗(yàn)證。
參考資料：
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