細(xì)胞分離液

細(xì)胞分離液

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Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞
（一）原理
Percoll是一種包有乙***的硅膠顆粒。滲透壓很低（<20mosm／kg H２O）, 粘度也很小，可形成高達(dá)1.3g／ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力（200～1000g）于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞無毒害，因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。
（二）操作方法及注意事項(xiàng)
1.不同濃度（密度）Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到性滲透壓，然后用溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃度。
Percoll濃度（％）　 70　     　60　     50　     40　      30　　  20
比重g／ml　          1.090      1.077      1.067    1.056     1.043     1.031
 2.不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤(rùn)，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長(zhǎng)針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時(shí)相鄰兩層Percoll比重相差不大時(shí)，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。
 3.裝樣：樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過大，細(xì)胞濃度也不可過高，否則會(huì)影響細(xì)胞的分離和回收。
 4.離心：一般采用離心力為400g，時(shí)間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時(shí)要慢，要平穩(wěn)。
 5.取樣：當(dāng)所要分離的細(xì)胞絕大部分在兩層的界面時(shí)，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞;有時(shí)大部分細(xì)胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細(xì)胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測(cè)用。
（三）分離純化細(xì)胞舉例
1.富含NK活性大顆粒淋巴細(xì)胞（LGL）的純化:按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如用10ml試管（或塑料管）分離,每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從外周血中分離的PBMC細(xì)胞1×10８懸于１ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細(xì)胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
 2.純化淋巴母細(xì)胞和細(xì)胞：分別疊加50％和30％Percoll液。收取經(jīng)PHA（或其它抗原、有絲分裂原）刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC（如腎綜合征出血熱患者），按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細(xì)胞為小淋巴細(xì)胞；兩層Percoll之間為淋巴母細(xì)胞，純度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死細(xì)胞。收獲淋巴母細(xì)胞可進(jìn)行表型、結(jié)構(gòu)以及功能的研究。
（四）人不同血細(xì)胞的漂浮密度表　人不同血細(xì)胞的漂浮密度
細(xì)　胞漂浮密度細(xì)　胞漂浮密度
紅細(xì)胞1.09-1.11淋巴細(xì)胞1.052-1.077
粒細(xì)胞　B淋巴細(xì)胞1.062-1.075
嗜酸性1.09-1.095T淋巴細(xì)胞1.065-1.077
嗜中性　1.080-1.085淋巴母細(xì)胞1.065-1.077
單核細(xì)胞1.050-1.066自然殺傷細(xì)胞1.050-1.070
血小板1.030-1.060　　

（五）問與答
問：請(qǐng)問percoll連續(xù)梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll連續(xù)梯度?
答：根據(jù)你需要的具體密度梯度決定的，根據(jù)要分離的不同細(xì)胞種類，數(shù)量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。另外，percoll本身是低滲透壓的，要用高滲透壓溶液配成等滲透壓溶液，然后使用，不然，細(xì)胞容易破裂。一般是先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到性滲透壓，然后用溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃度。即取Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9：1的比例混合，此時(shí)溶液 為100％ Percoll，比重是1.127，毫克分子滲透壓濃度為290mOsmol/kg。
（六） Percoll優(yōu)點(diǎn)
Percoll是經(jīng)過聚乙*** （polyvinyl pyrolidone, PVP） 處理的硅膠顆粒混懸液，對(duì)細(xì)胞無毒性和刺激性。Percoll混懸液的硅膠顆粒大小不一，經(jīng)過高速離心后，可形成一個(gè)連續(xù)密度梯度，將比重不同的細(xì)胞分離純化。 
因?yàn)镻ercoll具有滲透性低、不穿透細(xì)胞、粘度低、密度高和無毒害等優(yōu)點(diǎn)，與目前常用的密度梯度離心介質(zhì)，包括蔗糖（Sucrose）、血清白蛋白（Serum albumin, ALB）、聚蔗糖（Ficoll）、氯化銫（CsCl）等相比，是目前較理想的介質(zhì)。Percoll密度梯度離心已被多次成功地用于動(dòng)物細(xì)胞及其細(xì)胞器的分離，純化了包括人血液細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、紅血球細(xì)胞、白血球細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞等在內(nèi)的十余種動(dòng)物細(xì)胞。這一技術(shù)也開始用于用于分離和純化植物原生質(zhì)體、核、葉綠體和線粒體。