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在PCR實(shí)驗(yàn)過程中，我們經(jīng)常會遇到各種奇特的擴(kuò)增曲線，如何正確解讀這些曲線并且做出恰當(dāng)?shù)慕鉀Q方案是我們一線實(shí)驗(yàn)者需要練就的基本功。今兒，將多年累積的功力編成“武功秘籍”奉上，助你PK掉那些令人犯暈的異常曲線。

 

異常曲線1：PCR擴(kuò)增抑制

原因分析：H07存在擴(kuò)增抑制

 

解決方案：將樣本稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增（抑制物的影響可通過稀釋樣本消除

 

異常曲線2：自動基線設(shè)置問題

 

原因分析：自動基線問題

 

解決方案：手動設(shè)置基線。將Baseline End設(shè)置為“擴(kuò)增信號出現(xiàn)的前一個循環(huán)”即，圖片展原始為26，將其設(shè)置為20，點(diǎn)擊OK即可恢復(fù)正常曲線。

 

 

異常曲線3：熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果中無Ct值出現(xiàn)

 

 

原因分析：

（1）PCR參數(shù)設(shè)置錯誤：在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時沒有設(shè)置熒光信號采集；

（2）模板降解: 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況；

（3）引物或者探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；

（4）電腦設(shè)置了自動休眠。

 

解決方案：按照原因分析進(jìn)行一一核查，對癥處理。

 

 

異常曲線4：斜直線型擴(kuò)增曲線

 

PCR實(shí)驗(yàn)*檢測呈斜直線型擴(kuò)增曲線，再次復(fù)檢后結(jié)果基本均為正常陰性。

 

原因分析：

 

分液不準(zhǔn)確，檢查檢測后的反應(yīng)管可發(fā)現(xiàn)管內(nèi)的PCR反應(yīng)液量明顯少于正常管；反應(yīng)管氣密性差，反應(yīng)過程中溶液蒸發(fā)引起探針濃度增加，導(dǎo)致曲線呈斜直線狀。

 

解決方案：分液均勻，上機(jī)前檢查八連管液面是否在同一水平線上；八連管蓋蓋嚴(yán)，上機(jī)前檢查是否有縫隙。

 

 

 

異常曲線5：擴(kuò)增曲線末尾起跳

 

 

PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果中有曲線出現(xiàn)末尾起跳但是沒有完整擴(kuò)增的現(xiàn)象。

 

原因分析：

（1）陰參曲線末尾起跳，通常表示存在污染；

（2）復(fù)檢樣本，排除非特異性擴(kuò)增的可能性；

（3）正常樣本也可存在曲線末尾起跳，表示樣本濃度低或者加樣量不準(zhǔn)確。

 

解決方案：排除是否存在污染；排除污染原因后復(fù)檢樣本，如果復(fù)檢后曲線為陰性直線則說明之前的末尾起跳為非特異性擴(kuò)增，如果復(fù)檢后曲線仍與之前一致則說明末尾起跳表示該樣本中待檢病毒核酸的濃度偏低。

 

 

異常曲線6：山域型曲線

 

 

原因分析：嚴(yán)重的蒸發(fā)會呈現(xiàn)先上升后下降的曲線，輕微的蒸發(fā)會是一種緩慢的上升，這兩類異常的曲線可以看一下檢測后的反應(yīng)管液面是否有下降的現(xiàn)象來證明。

 

解決方案：上機(jī)檢測前檢查八連管管蓋，保證無縫隙后上機(jī)擴(kuò)增。

 

 

異常曲線7：擴(kuò)增曲線有向上或者向下的尖峰

 

 

原因分析：

（1）儀器不穩(wěn)定導(dǎo)致的擴(kuò)增曲線異常（也可能突然停電或者電壓不穩(wěn)）；

（2）如果尖峰向下，可能是鹵素?zé)衾匣掳l(fā)射光源不穩(wěn)定（指鹵鎢燈光源的激發(fā)器）

（3）如果是單一的孔位出現(xiàn)尖峰，除了考慮儀器或者孔位問題外，還要考慮反應(yīng)體系是否有氣泡所致。

 

解決方案：按照原因分析進(jìn)行一一核查，對癥處理。

 

 

背景知識

判斷擴(kuò)增曲線是否良好的指標(biāo)

 

 

 

1.曲線拐點(diǎn)清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好，基線平而無上揚(yáng)現(xiàn)象，低濃度樣本擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯。

 

2.曲線指數(shù)期斜率與擴(kuò)增效率成正比，斜率越大擴(kuò)增效率越高。

 

3.標(biāo)準(zhǔn)的基線平直或略微下降，無明顯的上揚(yáng)趨勢。

 

4.各管的擴(kuò)增曲線平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近。