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1.研究背景

脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是mRNA遞送的核心技術(shù)，但長(zhǎng)期冷凍保存會(huì)破壞LNP結(jié)構(gòu)。由于LNP內(nèi)部可含高達(dá)30%的水分，冷凍時(shí)，緩沖液結(jié)晶、pH漂移會(huì)破壞LNP膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致mRNA泄漏和轉(zhuǎn)染效率下降。而緩沖液的選擇是其中常被忽視的關(guān)鍵因素。

一項(xiàng)發(fā)表于 Molecular Pharmaceutics 的研究《Leveraging Biological Buffers for Efficient Messenger RNA Delivery via Lipid Nanoparticles》系統(tǒng)比較了三種常用緩沖液——HEPES（HBS）、Tris（TBS）和磷酸鹽緩沖液（PBS） 對(duì)DLin-MC3-DMA mRNA-LNP凍融前后性能的影響。結(jié)果證實(shí)：HEPES在保護(hù)LNP、維持體內(nèi)外轉(zhuǎn)染活性方面顯著優(yōu)于PBS。

2.核心發(fā)現(xiàn)

（1）HEPES在凍融后能維持LNP均一形態(tài)并形成獨(dú)特的“沙漏狀"結(jié)構(gòu)

新鮮制備時(shí)，三種緩沖液中的LNP在粒徑、分布和包封率上并無(wú)差異。但經(jīng)過(guò)凍融后，PBS和TBS中的LNP出現(xiàn)了明顯的聚集和大量小顆粒，而HEPES組不僅保持了均一的分布，還形成了獨(dú)特的“沙漏狀"形態(tài)。這種形態(tài)變化可能反映了脂質(zhì)膜的重組或局部去濕，為后續(xù)增強(qiáng)內(nèi)體逃逸提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

（2）HEPES能有效抑制凍融誘導(dǎo)的脂質(zhì)膜膨脹

凍融過(guò)程會(huì)顯著增加LNP脂質(zhì)膜的水合程度，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)松散、雙層厚度增加。相比之下，HEPES緩沖液中的LNP在凍融后膜水合變化最小，脂質(zhì)雙層厚度增幅遠(yuǎn)低于PBS和TBS組，表明HEPES能夠有效維持脂質(zhì)膜的致密排列，抑制凍融引起的膜膨脹，從而保護(hù)LNP的結(jié)構(gòu)完整性。

（3）HEPES在體外轉(zhuǎn)染中表現(xiàn)出優(yōu)秀的冷凍保護(hù)能力

在不同細(xì)胞系中，HEPES緩沖液均展現(xiàn)出最佳的冷凍保護(hù)效果。凍融后，HEPES組的轉(zhuǎn)染效率損失最小——在HeLa細(xì)胞中遠(yuǎn)低于PBS組，在HEK293T/17細(xì)胞中甚至無(wú)顯著下降。而PBS和TBS組均出現(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)染效率下降，說(shuō)明HEPES能更好地保留LNP的體外功能活性。

圖1 不同緩沖體系對(duì)mRNA-LNP細(xì)胞相容性與轉(zhuǎn)染表現(xiàn)的影響

（4）HEPES凍融后反而增強(qiáng)內(nèi)體逃逸能力

令人驚喜的是，HEPES不僅保護(hù)LNP免受凍融損傷，還在功能上帶來(lái)了額外收益。凍融后，只有HEPES組的內(nèi)體逃逸標(biāo)志（Gal9募集）顯著增加，而PBS和TBS組未見(jiàn)增強(qiáng)甚至有所下降。這一現(xiàn)象可能與HEPES誘導(dǎo)的“沙漏狀"形態(tài)變化有關(guān)，提示HEPES緩沖液能夠?qū)鋈谶^(guò)程轉(zhuǎn)化為有利于遞送的結(jié)構(gòu)重組。

圖2 不同緩沖體系對(duì)細(xì)胞 Gal9 激活的影響

（5）HEPES在體內(nèi)表達(dá)中冷凍保護(hù)效率高，PBS表現(xiàn)最差

盡管新鮮LNP中TBS組的體內(nèi)表達(dá)信號(hào)強(qiáng)，但凍融后4小時(shí)的絕對(duì)表達(dá)量已無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。若從冷凍保護(hù)效率（即保留率）來(lái)看，HEPES組的總通量下降幅度最小，PBS組下降幅度最大，損失近9倍。綜合考慮絕對(duì)表達(dá)量與保留率，HEPES是比PBS更優(yōu)的LNP冷凍儲(chǔ)存緩沖液選擇，而PBS最不推薦使用。

3.總結(jié)與啟示

HEPES和Tris緩沖的LNP在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染中整體優(yōu)于PBS。HEPES尤其出色，凍融后體內(nèi)活性保留最佳，內(nèi)體逃逸甚至增強(qiáng)。

PBS雖常用，但凍融后體內(nèi)活性損失高達(dá)9倍；而HEPES通過(guò)維持粒徑、抑制膜膨脹、誘導(dǎo)有利形態(tài)變化，顯著保護(hù)了LNP的遞送功能。

在mRNA-LNP的冷凍保存工藝中，不應(yīng)默認(rèn)使用PBS。選擇HEPES緩沖液可顯著提升凍融穩(wěn)定性，保障產(chǎn)品批間一致性與藥效。