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1.研究背景

脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是mRNA遞送的核心技術，但長期冷凍保存會破壞LNP結構。由于LNP內(nèi)部可含高達30%的水分，冷凍時，緩沖液結晶、pH漂移會破壞LNP膜結構，導致mRNA泄漏和轉(zhuǎn)染效率下降。而緩沖液的選擇是其中常被忽視的關鍵因素。

一項發(fā)表于 Molecular Pharmaceutics 的研究《Leveraging Biological Buffers for Efficient Messenger RNA Delivery via Lipid Nanoparticles》系統(tǒng)比較了三種常用緩沖液——HEPES（HBS）、Tris（TBS）和磷酸鹽緩沖液（PBS） 對DLin-MC3-DMA mRNA-LNP凍融前后性能的影響。結果證實：HEPES在保護LNP、維持體內(nèi)外轉(zhuǎn)染活性方面顯著優(yōu)于PBS。

2.核心發(fā)現(xiàn)

（1）HEPES在凍融后能維持LNP均一形態(tài)并形成獨特的“沙漏狀"結構

新鮮制備時，三種緩沖液中的LNP在粒徑、分布和包封率上并無差異。但經(jīng)過凍融后，PBS和TBS中的LNP出現(xiàn)了明顯的聚集和大量小顆粒，而HEPES組不僅保持了均一的分布，還形成了獨特的“沙漏狀"形態(tài)。這種形態(tài)變化可能反映了脂質(zhì)膜的重組或局部去濕，為后續(xù)增強內(nèi)體逃逸提供了結構基礎。

（2）HEPES能有效抑制凍融誘導的脂質(zhì)膜膨脹

凍融過程會顯著增加LNP脂質(zhì)膜的水合程度，導致膜結構松散、雙層厚度增加。相比之下，HEPES緩沖液中的LNP在凍融后膜水合變化最小，脂質(zhì)雙層厚度增幅遠低于PBS和TBS組，表明HEPES能夠有效維持脂質(zhì)膜的致密排列，抑制凍融引起的膜膨脹，從而保護LNP的結構完整性。

（3）HEPES在體外轉(zhuǎn)染中表現(xiàn)出優(yōu)秀的冷凍保護能力

在不同細胞系中，HEPES緩沖液均展現(xiàn)出最佳的冷凍保護效果。凍融后，HEPES組的轉(zhuǎn)染效率損失最小——在HeLa細胞中遠低于PBS組，在HEK293T/17細胞中甚至無顯著下降。而PBS和TBS組均出現(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)染效率下降，說明HEPES能更好地保留LNP的體外功能活性。

圖1 不同緩沖體系對mRNA-LNP細胞相容性與轉(zhuǎn)染表現(xiàn)的影響

（4）HEPES凍融后反而增強內(nèi)體逃逸能力

令人驚喜的是，HEPES不僅保護LNP免受凍融損傷，還在功能上帶來了額外收益。凍融后，只有HEPES組的內(nèi)體逃逸標志（Gal9募集）顯著增加，而PBS和TBS組未見增強甚至有所下降。這一現(xiàn)象可能與HEPES誘導的“沙漏狀"形態(tài)變化有關，提示HEPES緩沖液能夠?qū)鋈谶^程轉(zhuǎn)化為有利于遞送的結構重組。

圖2 不同緩沖體系對細胞 Gal9 激活的影響

（5）HEPES在體內(nèi)表達中冷凍保護效率高，PBS表現(xiàn)最差

盡管新鮮LNP中TBS組的體內(nèi)表達信號強，但凍融后4小時的絕對表達量已無統(tǒng)計差異。若從冷凍保護效率（即保留率）來看，HEPES組的總通量下降幅度最小，PBS組下降幅度最大，損失近9倍。綜合考慮絕對表達量與保留率，HEPES是比PBS更優(yōu)的LNP冷凍儲存緩沖液選擇，而PBS最不推薦使用。

3.總結與啟示

HEPES和Tris緩沖的LNP在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染中整體優(yōu)于PBS。HEPES尤其出色，凍融后體內(nèi)活性保留最佳，內(nèi)體逃逸甚至增強。

PBS雖常用，但凍融后體內(nèi)活性損失高達9倍；而HEPES通過維持粒徑、抑制膜膨脹、誘導有利形態(tài)變化，顯著保護了LNP的遞送功能。

在mRNA-LNP的冷凍保存工藝中，不應默認使用PBS。選擇HEPES緩沖液可顯著提升凍融穩(wěn)定性，保障產(chǎn)品批間一致性與藥效。