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近年來，siRNA 脂質(zhì)納米顆粒（siRNA-LNP）憑借優(yōu)異的靶向遞送能力，已成為基因治療、核酸藥物研發(fā)的核心載體。

 

但在實(shí)際制劑開發(fā)與儲(chǔ)存過程中，LNP 結(jié)構(gòu)易破壞、RNA 易降解、室溫穩(wěn)定性差，一直是困擾研發(fā)人員的痛點(diǎn)。傳統(tǒng)工藝常用 PBS 磷酸鹽緩沖液，卻容易誘發(fā)脂質(zhì)氧化、生成 RNA - 脂質(zhì)加合物，最終導(dǎo)致制劑藥效衰減、質(zhì)量失控。而組氨酸緩沖液的應(yīng)用，有望破解了這一行業(yè)難題。

 

穩(wěn)定性對(duì)比：組氨酸緩沖液更顯優(yōu)勢

 

研究顯示，組氨酸緩沖液在室溫下（25°C）儲(chǔ)存的siRNA-LNP穩(wěn)定性顯著高于傳統(tǒng)PBS緩沖液：

? 在初始時(shí)間點(diǎn)，組氨酸緩沖液（10 mM，pH 6.0，含 140 mM NaCl，滲透壓與 1×PBS 匹配）中的siRNA-LNP在外觀上與PBS緩沖液中的siRNA-LNP相似，但是六個(gè)月后，與PBS緩沖液中siRNA-LNP可見的聚集現(xiàn)象相比，組氨酸緩沖液中的siRNA-LNP即使在室溫下放置仍保持半透明狀態(tài)；（圖1）

? 在2-8℃和25°C條件下，PBS緩沖液中siRNA在24周內(nèi)發(fā)生明顯降解，而在組氨酸緩沖液，極大程度減少了siRNA的降解。（圖2）

? 在相同條件下儲(chǔ)存6個(gè)月后，在組氨酸緩沖體系中，其粒徑、多分散指數(shù)（PDI）和封裝效率均未發(fā)生顯著變化，均優(yōu)于PBS緩沖體系。（圖2）

這一結(jié)果表明，組氨酸緩沖液顯著延長了藥物的室溫穩(wěn)定性。

圖1：將LNP樣品從2–8 °C或25 °C的儲(chǔ)存條件下取出，并拍攝長達(dá)六個(gè)月的照片。紅色箭頭指示相分離發(fā)生的位置

圖2：在不同緩沖體系中，平均粒徑、PDI、包封率、完整的siHPRT 反義鏈、完整型 siHPRT 正義鏈 在不同溫度下隨時(shí)間變化情況

 

組氨酸抑制RNA-lipid加合物的形成

 

脂質(zhì)氧化是siRNA-LNP降解的核心問題。研究表明，不飽和脂質(zhì)（如MC3）在PBS中易生成親電性降解產(chǎn)物（E,Z-dienone），引發(fā)RNA-lipid加合物形成（圖3）。

? 在PBS中和tris緩沖液中，E,Z-dienone28天的生成率可達(dá)8%，而在組氨酸緩沖液中降至<1%以下（圖4C）。

? 在Tris緩沖液中封裝于LNP后，約68%的反義鏈發(fā)生脂化，相比之下，在組氨酸緩沖液中，僅檢測到約0.1%的脂化反義鏈（圖 4E）。

? 此外，還觀察到不必要的PS-PO轉(zhuǎn)化，每條鏈發(fā)生一次、兩次甚至三次，當(dāng)LNP分別儲(chǔ)存在含磷酸鹽或Tris的緩沖液中時(shí)，完整反義鏈的含量分別下降至12%或1%，而組氨酸緩沖液中的完整反義鏈含量依舊保持在84%以上（圖 4F）。

組氨酸緩沖液的弱酸性環(huán)境抑制了脂質(zhì)氧化反應(yīng)，減少了RNA-lipid加合物的形成，從而維持siRNA完整性。

圖3：MC31氧化生成 E,Z-二烯酮副產(chǎn)物2、RNA-脂質(zhì)加合物的可能機(jī)制

圖4：在不同緩沖液中 E,Z-二烯酮副產(chǎn)物2副產(chǎn)物、RNA-脂質(zhì)加合物比例、完整 siHPRT 反義鏈 ( F)的百分比

 

在 siRNA-LNP 制劑開發(fā)的全流程中，緩沖體系的選擇直接影響制劑的儲(chǔ)存周期、質(zhì)量可控性與臨床轉(zhuǎn)化潛力。

組氨酸緩沖液憑借抑制脂質(zhì)氧化、減少 RNA - 脂質(zhì)加合物生成、維持膠體穩(wěn)定性三大核心優(yōu)勢，解決了傳統(tǒng) PBS 體系的痛點(diǎn)，為核酸藥物的處方優(yōu)化與工藝開發(fā)提供了一定的數(shù)據(jù)支撐。

未來，隨著核酸藥物研發(fā)的持續(xù)推進(jìn)，組氨酸緩沖液有望成為更多 siRNA-LNP 制劑的“標(biāo)配"，助力更多治療藥物從實(shí)驗(yàn)室走向臨床，為患者帶來新的治療希望。