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本篇文章介紹了DOTMA在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗中的實驗步驟。

 

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗步驟

 

脂質(zhì)體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下方面的轉(zhuǎn)染方法之轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細胞。用LR進行轉(zhuǎn)染時，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h,開始按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者較佳的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時間，因LR對細胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24h為宜。

 細胞種類：C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。

 

 1、操作步驟(方法一)

 1）取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2m1含(1-2)x105個細胞的培養(yǎng)基，37℃、18%C02培養(yǎng)基40%-60%匯合時。

 2)轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染1個空細胞所用的A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,終量100u1。B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min,稍后會岀現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染

 3)轉(zhuǎn)染準備：用2m1不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1m1不含血清培養(yǎng)基

 4)轉(zhuǎn)染：把AB復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)

 5)其余處理：如觀察、篩選、檢測等與其他轉(zhuǎn)染法相同

 6)注意：轉(zhuǎn)染時切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

 

 2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟(方法二)

 ●……將細胞以5x105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h,使其達到50%-60%板底面積。

 ●……在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物

a、在1m1無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNAb、旋轉(zhuǎn)1s,再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

c、室溫下放置5-10min,使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。

 ●……棄去細胞中的舊液，用1m1無血清DMEM洗細胞1次后棄去，向每孔中直接加入1m1DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。吸出DEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養(yǎng)24-48h。用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定

 

 3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

 ●……接種細胞同前述，細胞長至50%

 ●……DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細胞同前。

 ●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養(yǎng)48h。

 ●……吸出DEM,用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細胞，使細胞生長一定時間篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。