ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作分析匯總

　　ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作全流程可分為試劑準(zhǔn)備、樣本處理、包被封閉、反應(yīng)孵育、洗滌顯色、結(jié)果判讀六大核心步驟?，結(jié)合不同實(shí)驗(yàn)方法的差異，具體操作和注意事項(xiàng)如下，可參考：

　　一、前期準(zhǔn)備：試劑與耗材預(yù)處理

　　試劑盒提前20分鐘從冰箱取出，平衡至室溫(18-25℃)，僅取出本次實(shí)驗(yàn)所需的酶標(biāo)板條，剩余密封保存避免受潮。

　　濃縮洗滌液用超純水按比例稀釋(一般為25倍稀釋)，若有晶體析出可40℃水浴助溶，配置好的洗液建議當(dāng)天使用。

　　標(biāo)準(zhǔn)品按照試劑盒說明書梯度稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用：已溶解的標(biāo)準(zhǔn)品建議12小時(shí)內(nèi)使用，稀釋好的梯度工作液建議2小時(shí)內(nèi)使用。

　　生物素標(biāo)記抗體、酶結(jié)合物工作液建議實(shí)驗(yàn)前30分鐘現(xiàn)配，不適合長期存放。

　　二、樣本處理

　　不同類型樣本處理方法不同，是去除雜質(zhì)避免干擾：

　　血清——室溫靜置30分鐘后，1000g離心15分鐘，取上清立即檢測(cè) 不檢測(cè)需分裝凍存于≤-20℃，避免反復(fù)凍融

　　血漿——EDTA/肝素抗凝，采集后30分鐘內(nèi)1000g離心15分鐘，取上清立即檢測(cè) 同血清保存要求

　　細(xì)胞培養(yǎng)上清——離心去除細(xì)胞碎片，若培養(yǎng)基含高濃度BSA需按要求稀釋后檢測(cè) 不檢測(cè)需分裝凍存

　　三、實(shí)驗(yàn)操作

　　ELISA常見方法分為直接法、間接法、夾心法、競(jìng)爭法，操作核心流程一致，僅包被和結(jié)合順序有差異：

　　包被?：將抗原或抗體溶于緩沖液，加入本生酶標(biāo)板孔，4℃靜置過夜(常用聚苯乙烯96孔板作為固相載體)。

　　封閉?：包被后用1%~5%脫脂奶粉或BSA溶液再次孵育，覆蓋未結(jié)合的固相載體表面，降低非特異性顯色導(dǎo)致的背景偏高。

　　加樣孵育?：加入待測(cè)樣本和酶標(biāo)記試劑，37℃水浴或孵育箱孵育30~60分鐘，保證抗原抗體充分結(jié)合。

　　洗板?：孵育后用洗滌液洗板3~5次，拍干去除未結(jié)合的游離反應(yīng)物，保證結(jié)果特異性。

　　顯色與終止?：加入底物溶液(常用TMB)，避光孵育顯色，達(dá)到預(yù)期顏色深度后加入終止液(一般為硫酸)終止反應(yīng)。

　　結(jié)果檢測(cè)?：用全波長多功能讀數(shù)儀測(cè)定各孔吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中待測(cè)物濃度。

　　四、常見問題及解決方案

　　初學(xué)者操作容易出現(xiàn)異常結(jié)果，常見問題處理如下：

　　白板(無顯色信號(hào))?：大概率是試劑過期、酶標(biāo)記物失活、洗滌液未按比例稀釋，需檢查試劑保質(zhì)期和配置比例，更換失效試劑。

　　花板(無梯度背景高)?：多因TMB底物未避光保存提前變藍(lán)、孵育溫度過高導(dǎo)致非特異性吸附，需更換底物、控制孵育溫度和時(shí)間。

　　顯色淺靈敏度低?：常見原因是洗板次數(shù)過多、洗滌沖擊力過大、顯色時(shí)間不足，調(diào)整洗板參數(shù)、延長顯色時(shí)間即可改善。

　　注：以上科研產(chǎn)品資料供參考，具體可咨詢技術(shù)老師!

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