ELISA操作要點(diǎn)：ELISA加樣技巧您了解多少!

　　那在ELISA實(shí)驗(yàn)中，加樣 一定是繞不開的一環(huán)!ELISA測定操作非常簡單，一般涉及到樣本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會影響測定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。

　　ELISA實(shí)驗(yàn)中一般需要 4 次加樣，即加樣本、加檢測抗體、加底物和加終止液。

　　● 實(shí)驗(yàn)室使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。ELISA比較敏感，每孔加入液體量誤差會導(dǎo)致最后讀數(shù)差別，因此避免儀器帶來誤差。

　　● 加樣前，溶液充分混勻，加樣時(shí)不可90度向孔中滴加液體，否則會導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

　　● 加樣品時(shí)，單孔用量要求：≥50ul/指標(biāo)，如需要做復(fù)孔則所需樣本量≥100ul/指標(biāo)。如果樣本量不充足，具體用量可咨詢您的專屬銷售。

　　● 加樣時(shí)速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。

　　● 加樣時(shí)避免液體濺出，如有樣本濺出，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干，并做相應(yīng)記錄。

　　● 每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個(gè)孔顯色時(shí)間相同。

　　● 加完顯色液后，放入一個(gè)可推拉的抽屜內(nèi)，就可以避光振蕩了。

　　加樣防錯(cuò)小竅門

　　● 用一張寫滿字的紙，字越多越好，比如報(bào)紙，墊在下面，這樣，加過標(biāo)本的小孔看過去下面的字會變小，沒加的字正常，非常容易區(qū)分。

　　● 可以利用液面反光與沒有加的孔加以區(qū)別。

　　(以下問題可能因多種原因引起，本文僅討論加樣的解決方法)

　　Q： 同一個(gè)樣本間的各個(gè)復(fù)孔的讀數(shù)有顯著性差異?

　　A： 加樣量多少不一，操作時(shí)間長短不一。重復(fù)同一樣本時(shí)，加樣量與加樣時(shí)間理應(yīng)相同，同時(shí)也應(yīng)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后可輕微晃動(dòng)酶標(biāo)板使反應(yīng)液充分混合。

　　Q： 陽性對照讀數(shù)不正常?

　　A： 加樣量不正確。應(yīng)保持每次加樣的步驟不要有太大的差異，有條件的應(yīng)該考慮使用排槍。

　　Q： 血清本底高?

　　A： 加樣時(shí)使用同一槍頭、交叉污染。每次吸樣注意更換吸頭，做到一樣一吸頭，避免交叉污染。

　　Q： 實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定的重復(fù)性差?

　　A： 1. 可能原因：加樣本及試劑量不準(zhǔn);孔間不一致;校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密;重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與第一次接近;重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性;樣品稀釋前應(yīng)充分混勻。

　　2. 可能原因：加樣過快，孔間發(fā)生污染;重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性;加樣不要過快。

　　3. 可能原因：加錯(cuò)樣本;檢查記錄和試劑，是否加錯(cuò)樣本。

　　4. 可能原因：加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū);加樣槍頭不要貼壁。

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