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收集單抗時，針頭濾器用量減半的好方法！
以制備或分析為目的而澄清哺乳動物細胞培養(yǎng)液樣本，對后續(xù)的純化步驟及分析儀器的平穩(wěn)運轉*。澄清步驟的總體目標是去除細胞培養(yǎng)液中的細胞、細胞碎片及其它粒子，同時確保目標產物得到足量回收。小體積（約小于25mL）澄清的常規(guī)程序是先對細胞培養(yǎng)液樣本進行離心，然后對離心后的上清液進行微孔過濾。盡管離心去除了一些粗糙的高密度粒子，但通常需要微孔過濾來去除離心上清液中的小粒子或低密度粒子。通過采用孔徑為0.2或0.22μm的無菌級過濾器（稱為除菌過濾器），微孔過濾還可同時發(fā)揮除菌滅菌的作用。
盡管離心步驟去除了絕大多數(shù)的粒子,但細孔過濾器往往會被堵塞，需要經常更換。這樣一來，導致過濾器耗量增大，且不利于人體工學操作。然而，通過選擇恰當?shù)尼橆^過濾器，可以減少過濾器耗量和相關操作時間。
本研究表明為CHO細胞培養(yǎng)液的澄清選擇恰當?shù)尼橆^過濾器在提升樣本通量的同時，還能減少過濾器耗量，不會對濁度、單克隆抗體產物回收率或總產率產生負面影響。選擇市面上常見的兩種孔徑為0.22μm的無菌針頭過濾器。盡管這兩種過濾器的有效過濾面積存在輕微差異，但二者均有聚醚砜過濾膜。
為了改善細胞培養(yǎng)上清液的過濾以促進細胞株的發(fā)育，本實驗進行了比較研究。我們基于以下參數(shù)：濁度、單克隆抗體回收率、相對產率、通量及過濾器用量，對Acrodisc®（頗爾公司，訂單號：4652，有效過濾面積（EFA）=5.8cm2）和Minisart® High Flow （賽多利斯，訂單號：16532-K，EFA=6.2cm2）針頭過濾器的過濾性能進行了研究。研究采用了從為期三個月的實際科研項目中采集到的CHO細胞培養(yǎng)液樣本。
在13個培養(yǎng)批次中，用到了十組目標蛋白和培養(yǎng)方法（見表1）。此外，還使用了125mL和1000mL搖瓶，以及5L的攪拌式生物反應器（賽多利斯 UniVessel）。采用貝克曼庫爾特公司的 Vi-CELL XR 檢測了細胞密度和存活率。作為目標蛋白，用來自不同IgG1、IgG2、fc融合蛋白及雙特異性抗體的單克隆抗體篩選了CHO細胞株?；诒Ｃ軈f(xié)議，隱匿了后一種抗體的具體名稱。
14天以后收集了所有的細胞培養(yǎng)批次；每一批次取兩份樣本（每種樣本多31mL），一份用Acrodisc®過濾器澄清，另一份用Minisart® High Flow過濾器澄清。先將兩份樣本（4000g）離心澄清60分鐘，然后將離心后的上清液分別用以上兩種針頭過濾器過濾（圖1）。
圖1：無菌條件下的初始澄清和隨后用孔徑為0.22μm的Minisart® High Flow針頭過濾器對細胞培養(yǎng)上清液進行除菌過濾。
分別在未收集到的細胞培養(yǎng)液和利用FortéBio公司裝有蛋白A生物傳感器（Pro A）的Octet QKe系統(tǒng)收集到的細胞培養(yǎng)液中測定單克隆抗體滴度，無需進行任何麻煩的樣液制備。由測定的滴度計算回收率。
對體積介于25mL~30mL的不同樣液進行比較后，即可計算出每份樣液的相對單抗產率（等式1）。
在澄清前后，用Lovibond公司的TurbiCheck WL 濁度計測量濁度值（白光光源）。然后，通過計算收集和未收集到樣液的濁度比測定降低的濁度。
本研究的目的是基于粒子減少、單抗回收率、產率和針頭過濾器耗量等參數(shù)，比較兩種不同針頭過濾器對澄清單抗上清液的適用性。
在實驗中我們用到了多個培養(yǎng)體系和表達載體。利用這種方法獲得了一系列不同的活細胞數(shù)、存活率、濁度、單抗產物和滴度（表1）。尤其是，收集的細胞培養(yǎng)液的濁度介于457NTU和1431 NTU之間；活細胞數(shù)范圍：4 × 106~16 × 106個細胞/mL；存活率：48%~89%；單抗滴度（細胞培養(yǎng)液）：0.2 mg/mL~8.8 mg/mL。結果的多樣性是準確說明針頭過濾器適用性的前提條件。
為了確定粒子減少量，我們分別測定了細胞培養(yǎng)液和濾液的濁度。結果表明兩種過濾器均能去除上清液中的雜質粒子。Acrodisc®過濾器過濾后的濾液平均濁度為17.7NTU；Minisart® High Flow過濾器過濾后的平均濁度為17.6 NTU。當考慮整個澄清過程時，即將離心和過濾結合考慮，終結果為濁度相對降低93.8%到98.8%。濾液的濁度明顯不依賴于初始細胞培養(yǎng)液的濁度（圖2）。
圖2：濁度降低幅度[%]與未澄清細胞培養(yǎng)液濁度的關系圖。澄清過程包括離心和微孔過濾。濁度的降低不依賴于細胞培養(yǎng)液的濁度。這一點對Minisart® High Flow和Acrodisc®過濾器均適用（由于數(shù)據點幾乎重合，因此圖中未顯示）。
表1：不同樣液類型（表達載體|單抗產物）及其參數(shù)概覽，如培養(yǎng)體系（STR = stirred tank reactor攪拌釜反應器，SF = shake flask搖瓶）、14天后的活細胞數(shù)（VCC）和存活率，以及收集細胞培養(yǎng)液的濁度。同時采用兩種針頭過濾器進行了澄清試驗，以分別利用兩種過濾器進行體積各異的澄清，從而獲得客觀的比較結果。
不同的細胞培養(yǎng)樣液產生了一系列不同的單抗滴度：0.2g/L~8.8g/L。兩種針頭過濾器品牌產生濾液的單抗滴度范圍均為0.2g/L~8.2g/L，終Minisart® High Flow過濾器的回收率介于89.9%到103.9%之間（平均回收率為97.7%），而Acrodisc®過濾器的回收率介于86.9%到107.3%之間（平均回收率為98.2%）。應該強調的是，回收率不依賴于細胞培養(yǎng)液滴度（圖3）。這一點對不同濃度水平培養(yǎng)過程中單抗滴度的定期監(jiān)測非常重要。
圖3：單抗產物回收率[%]與未澄清細胞培養(yǎng)液單抗滴度的關系圖；回收率不受針頭過濾器類型的影響，Acrodisc®的平均回收率為98.2%，Minisart® High Flow的平均回收率為97.7%。細胞培養(yǎng)液滴度介于0.3g/L~8.8g/L之間時，未發(fā)現(xiàn)針頭過濾器的使用對單抗回收率有影響。
盡管外殼設計和每份樣液所用過濾器的數(shù)量有所差異，但對于兩種針頭過濾器來說，每份樣液的相對產率均相同（圖4）。
圖4：多個單抗產物相對產率[%]的平均值。樣液的相對產率為濾液中單抗總量與未收集細胞培養(yǎng)液中單抗總量的比值。終結果表明，盡管針頭過濾器設計和過濾器用量有所差異，但兩種過濾器的相對產率相同。
為了比較通量和過濾器用量，我們?yōu)槊糠輼右捍_定了以下參數(shù)：上清液體積、總濾液體積以及所需的針頭過濾器數(shù)量。Acrodisc®的平均通量為9.3mL，Minisart® High Flow的平均通量為18.0 mL（圖5）。這種100%的差異無法用有效過濾面積（Acrodisc®: 5.8cm2，Minisart® High Flow：6.2cm2）的輕微差異解釋。這種現(xiàn)象更有可能是因為過濾器所用聚醚砜膜的結構設計存在差異所致。終發(fā)現(xiàn)Acrodisc®過濾器的平均使用率是每份樣液2.5個過濾器，Minisart ® High Flow的平均使用率是每份樣液1.4個過濾器。
圖5：CHO細胞培養(yǎng)上清液采用兩種不同的針頭過濾器（孔徑：0.22μm）過濾：賽多利斯 Minisart® High Flow 和頗爾公司 Acrodisc®。測定了每個針頭過濾器的平均通量。兩種過濾器的通量差異可能并非由有效過濾面積的差異所致（Acrodisc®: 5.8cm2, Minisart® High Flow: 6.2cm2），可能的原因是過濾膜結構設計的差異。
以上結果表明Minisart® High Flow過濾器的不堵塞過濾體積大于Acrodisc®，并且在濁度、單抗回收率及相對產率等參數(shù)中同樣體現(xiàn)出較高的性能。
