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提高昆蟲細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)率，它是之選
本研究中，筆者測試了作為一種全新技術的Sartoclear Dynamics® Lab V500，用于在Sf9細胞表達重組蛋白純化前，對細胞培養(yǎng)液進行快速澄清的效果。蛋白表達載體帶有一段信號編碼序列，從而確保表達后的蛋白能夠分泌到細胞外。因此，純化蛋白質之前必須去除培養(yǎng)基中的細胞，但是使用傳統(tǒng)方法操作（過濾后進行離心操作）十分費時。本文中，筆者通過與傳統(tǒng)方法進行對比，展示了Sartoclear Dynamics® Lab 過濾器的*性能。它不僅不會影響蛋白產(chǎn)量，還能節(jié)省大量時間；對于任何致力于提高昆蟲細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)率和通量的實驗室來說，它必將是之選。
引言
了解蛋白質的三維結構是理解其功能的關鍵。對于疾病中所涉及的蛋白質，三維結構信息將有助于設計出針對靶向目標的、具有高度特異性的新型藥物。
純化蛋白對于測定結構十分重要。如今，使用不同的蛋白表達系統(tǒng)已經(jīng)成為眾多實驗室的慣例做法。表達系統(tǒng)的選擇通常取決于物種、蛋白的修飾程度和目標蛋白質的產(chǎn)量。在表達載體中使用信號序列，可在細胞培養(yǎng)基中分泌出純度相對較高的表達蛋白質，且無需使用昂貴的細胞破碎設備，還能夠很大程度地縮短優(yōu)化純化方法[1]所需的時間。然而，該方法存在重大缺點，即在純化之前需要耗費大量時間才能澄清大量的細胞培養(yǎng)液。此外，所使用的離心機處理量有限，這還會增加澄清培養(yǎng)基所需的時間，因為它必須多次運行才能達到我們的需要。筆者還注意到，在過濾昆蟲細胞培養(yǎng)基時，即使已經(jīng)通過離心去除了細胞，流速仍舊很慢。這可能與存在亞微米粒子有關，在哺乳動物細胞培養(yǎng)液離心操作后，它仍懸浮于其中，從而導致堵塞過濾膜[2]。
當初開發(fā)Sartoclear Dynamics®系列過濾產(chǎn)品是為了大大減少從培養(yǎng)液中過濾哺乳動物細胞所需的時間。通過向培養(yǎng)液中添加硅藻土，可促進多孔濾餅成型，進而防止過濾器堵塞，并快速獲得樣品中的細胞培養(yǎng)上清液（圖1）。由于無需離心操作步驟，因此可避免由于離心容量和可用性所導致的問題。對于筆者的研究而言，昆蟲細胞能夠表達并分泌目標蛋白，必須對培養(yǎng)上清液進行純化。因此，筆者測試了Sartoclear Dynamics®用于澄清昆蟲細胞（包含目標蛋白）培養(yǎng)上清液的效果，并將結果與標準方法進行了對比。
圖1：使用傳統(tǒng)方法和Sartoclear Dynamics® Lab 主體加料過濾方法澄清細胞培養(yǎng)液的原理
材料和方法
采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)來表達目標蛋白。根據(jù)制造商的說明，在Sf-900™ II SFM (Thermo Fisher Scientific, 10902088) 中培養(yǎng) Sf9 細胞 (Thermo Fisher Scientific, 11496015 ) 。使用帶有目標蛋白編碼基因的桿狀病毒感染1.5L的懸浮培養(yǎng)液，并在27°C溫度下以240 rpm的轉速震蕩孵化90個小時。
收獲培養(yǎng)液并分成三個470 mL等量樣本，用于澄清和蛋白質純化。份等量樣本使用標準方法進行澄清。將細胞5,000g離心15分鐘后，將上層清液通過 0.22 μm的PES過濾器。然后，使用Sartoclear Dynamics®系統(tǒng)澄清第二和第三份樣本。添加5或10g硅藻土，并將溶液混合成均勻的懸浮液，然后使用0.22μm的PES過濾器對培養(yǎng)液進行過濾。
使用金屬鰲合親和層析（IMAC）方法純化細胞培養(yǎng)基中每個澄清樣本的蛋白質。將培養(yǎng)基串聯(lián)加載至 5 × 1 mL HisTrap層析柱中（通用生命科學部，17-3712-05），并使用HTE緩沖液（50mm HEPES、500mm NaCL、pH 7.4）進行預平衡。使用100 mL HTE緩沖液和75 mL（包含25mm咪唑）的HTE緩沖液清洗層析柱，以去除雜質，并使用25 mL（包含500mm咪唑）的HTE緩沖液洗脫目標蛋白。
結果與討論
通過收獲細胞培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)：每毫升總細胞密度的測量值達1.5 × 106。
記錄澄清每種細胞培養(yǎng)液樣品所花的時間（圖2）。將記錄時間分為制備時間（即測量培養(yǎng)液容量和平衡離心管或添加分別用于標準方法或Sartoclear Dynamics® 方法的硅藻土）、離心時間（于標準方法）和過濾時間（兩種方法）。
圖2：根據(jù)處理時間比較澄清方法。Sartoclear Dynamics® Lab 大大降低了澄清細胞培養(yǎng)基所需的時間。
使用標準離心過濾方法制備澄清細胞培養(yǎng)基，大約需要34分鐘。盡管相對于標準方法，使用含5g硅藻土過濾優(yōu)化的Sartoclear Dynamics® 并未減少過濾時間，但是略去離心步驟意味著至少可減少53%的總制備時間。將硅藻土數(shù)量增加至10g，總制備時間可減少6分鐘，至少可節(jié)省 82 %的時間。
就通量而言，標準方法及使用5g和10g硅藻土過濾優(yōu)化的方法的過濾時間分別等同于2.35、2.35 和 14.1 L/h的流速。使用5g硅藻土制備樣品過程中，過濾期間可觀察到硅藻土和細胞出現(xiàn)部分沉降現(xiàn)象?？赡芄柙逋猎缙诔两祵е铝肆魉僖欢ǔ潭壬系慕档汀ｏ@然，絕大多數(shù)硅藻土/細胞混合物可通過輕輕搖晃過濾裝置即可重新懸浮，使流速回到正常水平；但過濾更高細胞密度培養(yǎng)液時，使用10g硅藻土的規(guī)格，應該更為合適。
為了測試Sartoclear Dynamics®對蛋白產(chǎn)量的影響，應采用IMAC方法純化每個樣品中的蛋白質，并比較洗脫峰的大?。▓D3）。與使用標準方法制備樣品所出現(xiàn)的洗脫峰相比，利用含10g硅藻土過濾優(yōu)化的Sartoclear Dynamics®系統(tǒng)制備樣品可產(chǎn)生具有更高吸光度的洗脫峰，其表明存在更多的蛋白質。但是相比而言，標準方法所產(chǎn)生的洗脫峰較寬（即容量較高），因此使用硅藻土混合樣品基本上不會影響蛋白產(chǎn)量。
圖3：使用標準離心過濾方法和經(jīng)10g硅藻土優(yōu)化的Sartoclear Dynamics® Lab過濾系統(tǒng)制備樣品，比較兩者之間的蛋白質洗脫峰 (★)。
結論
Sartoclear Dynamics® Lab可加快細胞培養(yǎng)基的澄清過程。使用該過濾系統(tǒng)將無需采取離心操作，節(jié)省大量時間，并顯著提高生產(chǎn)力和通量。使用硅藻土混合樣品后，并未對蛋白質產(chǎn)量產(chǎn)生負面影響。
該系統(tǒng)有多種型號可選，可用于澄清15mL至1L批量的細胞培養(yǎng)基，能夠滿足用戶的眾多需求。
