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一種簡單的微環(huán)DNA制備與純化方法
宮頸癌(CC)是全世界婦女中常見的癌癥之一，由人乳頭瘤病毒(HPV)，也就是其毒性強(qiáng)的高危基因型HPV-16和HPV-18引起。持續(xù)感染后，HPV16/18編碼E6和E7腫瘤蛋白，分別負(fù)責(zé)抑制和降解p53和pRB腫瘤抑制蛋白。
過去幾年人類一直在探索基因療法用于治療此類不治之癥。Minicircular DNA(mcDNA)由于沒有原核序列，能很大程度的減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后原核元件對轉(zhuǎn)染效果和基因組的影響，因此被認(rèn)為是一種很有前途的載體。然而，其實(shí)現(xiàn)的生物技術(shù)過程涉及很多步驟，這對制藥行業(yè)來說就會(huì)比較昂貴。
為了簡化步驟，使mcDNA的制備方法更加簡單可行，貝拉大學(xué)健康科學(xué)研究中心、快速和可持續(xù)產(chǎn)品開發(fā)中心和賽多利斯公司聯(lián)合開發(fā)了一種新的制備方法，該方法使用Sartoclear Dynamics® Lab(硅藻土與負(fù)壓濾器組合套裝)直接過濾并去除所有細(xì)胞碎片和沉淀的雜質(zhì)，并結(jié)合使用膜層析柱Sartobind Q75 進(jìn)行純化作為第二步以去除 RNA。
結(jié)果
1 用Sartoclear Dynamics® Lab處理粗裂解液的結(jié)果比較
這種方法僅需的一個(gè)過濾步驟就可快速獲得澄清的裂解物，而不是像傳統(tǒng)方法那樣使用有機(jī)溶劑和高鹽并進(jìn)行三個(gè)離心的繁瑣過程。
2 使用Sartobind® Q75膜(季銨配體)進(jìn)行純化(季銨鹽配體)
用10mM Tris，0.1M EDTA，pH8.0(基礎(chǔ)緩沖液)進(jìn)行平衡；加載 30 mL用DE處理的裂解液。
大多數(shù)RNA雜質(zhì)在上樣步驟中被直接去除，通過增加NaCl離子強(qiáng)度，最終獲得了分離的DNA。
結(jié)論
• 使用Sartoclear Dynamics® Lab用硅藻土和過濾處理裂解物，與傳統(tǒng)方法相比，可以節(jié)省大量時(shí)間、資源和環(huán)境影響
• 在對平衡和洗脫條件進(jìn)行一些初步研究后，Sartobind Q75層析膜可以成功去除RNA雜質(zhì)并分離純度高于90%的DNA
• 可繼續(xù)進(jìn)行一些研究以獲得分離的mcDNA載體并獲得最大產(chǎn)量
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-本文摘自-
New Combined Approach to Simplify the Minicircular DNA Lysate and Directly Apply in Ion Exchange Membrane Chromatography
Mater. Proc. 2022, 8(1), 41;
Published: 24 May 2022
