海腎熒光素酶報告基因檢測試劑盒（藥物篩選）

產(chǎn)品描述

海腎螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Renilla Luciferase Reporter Gene Assay Kit)以腸腔素(Coelenterazine)為底物來檢測海腎螢光素酶(Renilla reniformis luciferase，簡稱renilla luciferase)活性的試劑盒。海腎螢光素酶是一種分子量約為36kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化Coelenterazine氧化成Coelenteramide。在Coelenterazine氧化的過程中，會發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。生物螢光可以通過化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)進行測定。

(Renilla Luciferase Reporter Gene Assay Kit)提供了一種快速、靈敏、高效的檢測目的基因表達的系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)不依賴ATP。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在luciferase的上游，或把3’-UTR區(qū)克隆在luciferase的下游等，構(gòu)建表達系統(tǒng)。用適當(dāng)藥物等處理細胞后，測定螢光素酶活性。通過螢光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對目的基因轉(zhuǎn)錄、表達的調(diào)控作用。海腎螢光素酶一方面常用作螢火蟲螢光素酶報告基因檢測的內(nèi)參，以消除由于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率不同而帶來的誤差；另一方面海腎螢光素酶也可以和螢火蟲螢光素酶一樣被用于常規(guī)的報告基因檢測。

技術(shù)原理

Coelenterazine + O2 → Coelenteramide + CO2 + Light (~ 480 nm)

產(chǎn)品包裝

使用方法

1. 準(zhǔn)備細胞

1.1 貼壁細胞: 細胞生長培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，使細胞密度達到1,000 -10,000 個/90 µL/孔 (96孔板) 或 250-2,000個/20 µL/孔 (384孔板).

1.2 懸浮細胞：離心細胞培養(yǎng)液，然后用細胞培養(yǎng)基重懸細胞，使細胞密度在多聚D-賴氨酸96孔板達到20,000-200,000 個/90 µL/孔或5000-50,000個/20 µL/孔（多聚D-賴氨酸384板）。反應(yīng)前800 rpm離心96孔或384孔板2分鐘。

注意: 1）不同的細胞處理需要不同的細胞密度，在反應(yīng)前一天或?qū)嶒灝?dāng)天細胞制備，要考慮細胞類型和細胞處理。

2）建議使用白色96孔板或384孔板以獲得*結(jié)果。

3）建議使用沒有酚紅的培養(yǎng)基，EMEM, MEM會吸收luciferases發(fā)出的光線，淬滅要觀察的光信號。

2. 準(zhǔn)備Renilla luciferase試劑盒反應(yīng)液  按照1:100體積比，將熒光素酶底物（組分A）加入緩沖液（組分B）。

注意：Renilla luciferase試劑盒反應(yīng)液對光線非常敏感，操作中應(yīng)避光，并全程在冰上操作，配好后在2小時內(nèi)使用。暫時不用應(yīng)避光放置于-20℃保存，存放時間1周左右。

3.處理細胞：

3.1 步驟1準(zhǔn)備好的細胞，96孔板每孔加入10µL 的10X 待測化合物溶液（藥品或化合物），如果是384孔板，則每孔加入5 µL的5X化合物溶液。

3.2 加入化合物的細胞在37℃, 5% CO2條件下根據(jù)化合物作用要求培養(yǎng)一定時間，一般為4小時或過夜培養(yǎng)。

4. Renilla luciferase檢測

4.1 步驟3.2培養(yǎng)的細胞，*移除細胞培養(yǎng)液

4.2 去除培養(yǎng)液的96孔板，每孔加100 µL Renilla luciferase反應(yīng)液（步驟2配制），如果是384孔板則每孔加入25 µL。室溫、避光孵育反應(yīng)5-10分鐘。

4.3 檢測 用化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)進行光密度測定。