Quick Cell TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（紅色）

產(chǎn)品描述

 DNA斷裂是晚期細(xì)胞凋亡的一個特征。DNA在細(xì)胞凋亡過程中被激活的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶切割成大小不同的片段，并同時產(chǎn)生與切口相同數(shù)目的3'-OH末端，末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)能識別并把脫氧核糖核苷酸連接到切口的3'-OH。TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling)是一種通過預(yù)先標(biāo)記脫氧核糖核苷酸（dUTP），間接標(biāo)記DNA切口3'-OH，進(jìn)而通過觀察熒光反映細(xì)胞凋亡情況的檢測方法。

李記生物研發(fā)的主要在兩個方面做了改進(jìn)：1）在Alexa Fluor的基礎(chǔ)上改進(jìn)了染料，使熒光更為穩(wěn)定；2）本試劑盒采用不含甲胂酸鈉(sodium cacodylate)的專有緩沖液，確保檢測結(jié)果真實反應(yīng)細(xì)胞凋亡情況。幾乎所有的TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒都包含甲胂酸鈉(sodium cacodylate)，這種化合物對細(xì)胞有高度毒性，這種高毒性可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)DNA降解產(chǎn)生DNA單鏈或雙鏈片段，使細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果失真。提供了反應(yīng)所需的全部組份，可用于多功能酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測，可用TRITC通道或設(shè)置Ex /Em = 550nm/590-650 nm檢測信號。

試劑盒組成

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃避光保存，保質(zhì)期12個月。

使用方法（以96孔板為例）

1. 準(zhǔn)備

  a. 培養(yǎng)細(xì)胞到合適密度。貼壁細(xì)胞*密度30000-50000 細(xì)胞/孔（96孔板）,懸浮細(xì)胞*密度1-2 x 106 細(xì)胞/mL。陰性和陽性對照的細(xì)胞同時培養(yǎng)或調(diào)整到相同  密度，陽性對照根據(jù)需要確定是否設(shè)置。

  b. 準(zhǔn)備試劑：4%甲醛細(xì)胞固定液；細(xì)胞通透液（0.2% Triton X-100 in PBS選做）；DNA酶 I反應(yīng)液（選做）

2. 固定細(xì)胞增加通透性

  a. 去除培養(yǎng)液，每孔添加100 μL 的4%甲醛固定液，在室溫條件下孵育20-30分鐘，去除固定液。

  b.根據(jù)需要選做：添加100μL/孔的細(xì)胞通透試劑（0.2% Triton X-100 in PBS. 需自備），在室溫孵育10分鐘。

  c. 用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次

  d. 若設(shè)置陽性對照，可在TUNEL反應(yīng)前，在陽性對照樣品中加入DNA酶 I，室溫孵育30分鐘后，與樣品一同進(jìn)行TUNEL反應(yīng)。

3. TUNEL反應(yīng)

  a. 按下表準(zhǔn)備反應(yīng)混合液（多樣品檢測可參考表中數(shù)據(jù)放大，不同細(xì)胞系可摸索建立*反應(yīng)體系。）

  b. 每孔加入50 μL上一步配好的反應(yīng)混合液，37℃孵育60分鐘。

  c. 去除反應(yīng)混合液，每孔用200 μL的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3-5次。

4. 觀察熒光信號，可以用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀在Ex /Em = 550nm/590-650 nm條件下觀測。

5. (選做)用1 X Hoechst(組份C, Ex/Em=350/460nm)染色做成像分析。