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活性檢測CCK-8細胞增殖與毒性檢測試劑盒

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 細胞增殖與活性檢測試劑盒是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。其主要成分為水溶性四唑鹽WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜（formazan，參考圖1)。WST-8 被細胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的甲臜能夠直接溶解在培養(yǎng)基中。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

圖1：WST-8分子結(jié)構(gòu)及檢測原理

運輸與保存方法

冰袋運輸。CCK-8在4℃可保存一年，在-20℃可以存放數(shù)年，反復凍融會造成測定背景O.D值升高，如經(jīng)常使用，建議存放于4℃即可。

操作方法

1. 在96孔板中配制100 μl的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24小時 (在37℃，5% CO2的條件下)。

2. 向培養(yǎng)板加入10 μl不同濃度的待測物質(zhì)。如果測定細胞活性，則不需要2-3步驟，直接從第四步操作。

3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間 (例如: 6,  12, 24或48小時)。

4. 向每孔加入10 μl CCK-8溶液 (注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D值的讀數(shù))。

5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

6. 用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

注意事項

1）CCK-8試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化反應(yīng)，如果待檢測體系中有較多還原劑（或抗氧化劑）會造成背景O.D值升高，干擾檢測結(jié)果。如果實驗中有還原劑，請檢查背景的O.D值，即測定、比較空白培養(yǎng)基加入藥物與不加藥物的培養(yǎng)基（含細胞）在加入CCK- 8試劑后的O.D值，如果空白O.D值明顯偏高，則說明有反應(yīng)，應(yīng)設(shè)法去除或折算干擾因素。

2）如果細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，應(yīng)洗滌細胞更換培養(yǎng)基后再加CCK-8檢測。細胞培養(yǎng)基酚紅不影響測定結(jié)果。

3）為使CCK-8試劑盒培養(yǎng)基充分混勻，減少CCK-8在移液器上的殘留，建議加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑，混勻后加樣。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 CCK-8與同類試劑比較

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