引言
開發(fā)一種高效且穩(wěn)健的全氟和多氟烷基物質(zhì)（PFAS）識別和定量策略對于PFAS的監(jiān)測和風險評估至關(guān)重要。目前，EPA 1633方法是較全面和較有效的方法，涵蓋了不同樣品基質(zhì)中的40種全氟辛烷磺酸，包括地表水、廢水、土壤、沉積物、生物固體以及魚類和貝類組織1。不同基質(zhì)的樣品制備程序各不相同。
本文重點介紹了不同固體樣品的樣品制備和分析，使用雙層SPE小柱(GCB/WAX)樣品提取和溶劑萃取后的凈化，并采用QSight LC-MS/MS系統(tǒng)進行全氟和多氟烷基物質(zhì)（PFAS）分析。本應(yīng)用文獻是系列文獻中的第三篇，涉及方法開發(fā)、不同基質(zhì)下的樣品制備以及使用珀金埃爾默*的工作流程應(yīng)對EPA 1633的方法性能展開詳細闡述。有關(guān)地表水和廢水樣品的LC-MS/MS方法優(yōu)化和工作流程開發(fā)，請參閱應(yīng)用筆記第一部分和第二部分。2-3
亮點
?基于EPA 1633方法，展示了一套完備的工作流，可用于分析沙子、土壤、沉積物、污泥、生物固體和相關(guān)固體樣品中的40種PFAS。
?固體樣品符合EPA 1633的所有性能要求，證明了該工作流程對復雜樣品基質(zhì)的能力和等效性。
?使用雙層SPE小柱(WAX/GCB)不僅能簡化樣品制備的步驟，節(jié)約時間，還可以通過自動固相萃取流程來提高分析物回收率和準確率。此外，它還克服了使用分散型GCB的危險。
?可通過第三方能力驗證樣本結(jié)果來驗證工作流性能。
在本文對固體樣品的研究中，使用自動固相萃取系統(tǒng)評估方法性能，包括樣品基質(zhì)效應(yīng)、萃取效率、分析物回收率。使用已開發(fā)的工作流程分析了共11種固體樣品以及質(zhì)量控制(QC)樣品，如實驗室空白試劑(LRB)、實驗室方法空白樣品(MB)、實驗室空白濃縮樣品(LFB)、實驗室強化基質(zhì)(LFM)以及第三方能力驗證樣品(PT)。在大多數(shù)研究的樣本中，全氟辛烷磺酸的含量很低或沒有發(fā)現(xiàn)，但采購于多倫多Mimico Creek的黑色園土中檢測到了超過10種低含量的PFAS 。在這些生物固體樣本中發(fā)現(xiàn)了一些長鏈全氟和多氟烷基物質(zhì)，如PFOS、PFOSA、NMEFOSAA、NETFOSAA和NETFOSE。
1 實驗部分
安全第一
多種全氟烷基物質(zhì)(PFAS)包括全氟辛酸(PFOA)被列為可能對人類致癌的物質(zhì)，應(yīng)將人類接觸這類化合物的暴露水平降至盡可能低。在開展實驗前及實驗過程中，必須配備個人防護裝備，實施安全培訓，并嚴格執(zhí)行安全操作規(guī)程。生物固體樣本可能含有高濃度的有害物質(zhì)，因此必須佩戴手套進行處理，并在通風櫥或生物安全柜中打開樣本，以避免接觸。實驗室工作人員應(yīng)當了解并遵守微生物實驗室中處理病原體和生物廢棄物樣本時所必需的安全規(guī)程和相關(guān)規(guī)定。詳見EPA 1633第5.0至5.4節(jié)。1
化學品、標準制備和分析條件
相關(guān)分析條件(化學品、標準品制備和儀器參數(shù))系列文獻的第一篇2。
樣品收集
一種沙子樣品(S1)和兩種沉積物樣品(S2和S7)獲取于多倫多安大略湖沿岸的不同海灘區(qū)域。污泥樣品(S3)獲取于多倫多Mimico Creek地區(qū)。園土樣本(S4)獲取于我在安大略省Kitchener的自家后院。從花園商店購買黑色園土(S5)購于商店 ，并用于種植韭菜(S10，一種受歡迎的中國蔬菜)。人類糞便樣品(S6)在家中收集。兩種生物固體樣品(S8和S9)由加拿大環(huán)境和氣候變化技術(shù)處的Anne Smyth博士提供。煮熟的豬血樣品(S11)購于安大略省伍德布里奇的當?shù)貋喼奘称烦?。EPA 1633 能力驗證樣品(PFC PT-SOIL-EPA 1633，Part#38722)獲取于Absolute Standards Inc。所有樣品均收集在清潔的樣品瓶(HDPE，帶聚丙烯蓋)中。圖1展示了本研究中收集和分析的固體樣品。
圖1.進樣順序：通過連續(xù)進樣食品基質(zhì)提取物評估穩(wěn)定性，這些提取物以溶劑QC樣本為間隔進行注射(每5次溶劑QC進樣100次食品基質(zhì)進樣)(點擊查看大圖)
樣品制備
固體樣品分析的工作流程如下圖2所示
圖2.固體樣品分析的LC-MS/MS工作流程(點擊查看大圖)
為了提取固體和生物固體樣品，通過以下步驟制備提取0.3%氫氧化銨的甲醇溶液：將1mL 30%的氫氧化銨加入到甲醇(99mL)中，在室溫下儲存，1個月后更換。固體(或生物固體)樣品通過以下程序制備(或參考EPA方法第11.3和12.0節(jié))1。
• 稱取5g樣品(生物固體為0.5g)至50mL聚丙烯(PP)離心管中。
• 加標25µL提取的內(nèi)標混合物(EIS)(MPFACHIF-ES，來自惠靈頓)。
• 旋轉(zhuǎn)樣品以分散標準品，并靜置30分鐘。
• 加入10mL提取液，振蕩30分鐘，然后離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的50毫升PP管中。
• 加入15mL提取液，重復上述步驟，將上清液轉(zhuǎn)移至同一試管中。
• 加入5mL提取液，振搖5分鐘，然后離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到同一試管中。
• 在氮氣下濃縮至7mL(55°C)。
• 用水復溶至50mL，混合均勻。
• 檢查pH值，并將其調(diào)整至6左右(6.5±0.5)。
• 執(zhí)行自動SPE清理。
• 向洗脫液中加入25µL非提取內(nèi)標(NIS)混合物(MPFAC-HIF-IS，來自惠靈頓)和25µL濃乙酸，充分混勻。
本研究中使用雙層GCB/WAX固相萃取柱代替WAX固相萃取柱，再進行脫碳凈化處理，減少了樣品提取和凈化時間，并最大限度地減少了手動操作誤差。
在樣品瓶和SPE柱之間使用入口過濾器，以防止顆粒堵塞SPE柱。以上所有萃取流程均使用 Promochrom SPE-03自動進樣系統(tǒng)(Promochrom Technologies，Richmond，BC， Canada)，以減少人力成本，并最大限度地減少人為錯誤。
2 結(jié)果與討論
方法性能和驗證
方法選擇性和真實樣品中PFAS的確認
該方法的選擇性和樣品中PFAS分析物的確認通過比較分析物保留時間和MS信息(例如參考標準品和測試樣品之間的分析物定量/定性離子豐度比 [IAR])進行評估。根據(jù)關(guān)于分析方法驗證的監(jiān)管指導，該LC-MS/MS方法應(yīng)至少使用兩個結(jié)構(gòu)特異的MS/MS轉(zhuǎn)換離子對14-164-6。美國EPA方法1633要求樣品的IAR必須在所觀察到的中間點初始校準標準品的IAR的±50%范圍內(nèi)，并且該比率要求不適用于PFBA、PFPeA、NMeFOSE、NEtFOSE、PFOSA、PFMPA和PFMBA，因為沒有合適的(無法檢測或S/N不足)二級離子對可用。
在本研究中，該方法盡可能針對每種分析物使用了兩個或三個MS/MS離子對，以對研究樣品中 PFAS 的目標峰進行定性確認，并確定除PFBA和PFOSA(其二級離子對的S/N不足)外，真實水樣中所有測定的 PFAS分析物的IAR值均在預期值容差窗的±40%范圍內(nèi)。有關(guān)樣品分析結(jié)果和IAR值(表5-6)，請參閱本文最后一節(jié)。
儀器靈敏度（LOQ）和方法檢測限（MDL）
通過測量最低濃度校準標準品的信噪比(S/N)來確定儀器靈敏度(參見EPA方法第7.3.4、10.3.3.1和13.3節(jié))。在本研究中，定量離子和確證離子的定量限(LOQ)由S/N≥3:1確定，如果分析物只有一個定量離子，則S/N≥10:1。
方法檢測限(MDL)是指能夠以99%的置信度報告可將分析物的實測濃度與方法空白結(jié)果區(qū)分開來的最小濃度。每個實驗室必須使用40 CFR Part 136.7中的為所有目標分析物建立MDL。在本研究中，使用了若干低水平持續(xù)精密度和回收率(LLOPR)樣本以及方法。
三份方法空白樣品分別在三個不同日期進行了分析，然后從所有LLOPR樣品和空白中計算PFAS濃度。LLOPR是持續(xù)存在的精密度和回收率樣品，其濃度為實驗室LOQ的兩倍，并用作儀器靈敏度的常規(guī)檢查。在本研究中，由于空白樣品未檢測到PFAS，因此使用11個LLOPR 樣品的結(jié)果來計算每種分析物的平均PFAS含量和標準偏差(STDEV)。
MDL=T( n-1，0.99)x STDEV，其中當n=11時，T(n-1，0.99)=2.764。因此，MDL= 2.764 x STDEV 。
表1列出了本研究中獲得的MDL和LOQ值以及EPA組織的實驗室間研究的匯總結(jié)果(見EPA方法表9 1)。
表1.本研究中獲得的方法檢測限(MD)和定量限(LOQ)以及EPA組織的實驗室間研究的匯總結(jié)果(點擊查看大圖)
樣品基質(zhì)效應(yīng)和儀器靈敏度檢查
通過比較非提取內(nèi)標物(NIS)的峰面積與校準標準品中內(nèi)標物平均峰面積的差異 ，對樣品基質(zhì)效應(yīng)進行了研究。EPA方法還利用這些結(jié)果來檢查儀器靈敏度變化(見EPA方法第14.9節(jié))。如表2所示，所有回收率結(jié)果均在EPA方法設(shè)定的50-200% 范圍內(nèi)(EPA方法1中的表8)。
表2.樣品中未提取內(nèi)標物(NIS)的回收率(%)(點擊查看大圖)
*樣品S2和S7的回收率與S1相似，因此此處未顯示其數(shù)據(jù)。
方法萃取效率
方法萃取效率通過從地表水樣品中回收提取出的內(nèi)標物(EIS)以及使用響應(yīng)因子計算得出的QC樣本來評估(比較樣品中內(nèi)標與NIS的峰面積比/濃度比)。如表3所示，所有回收率結(jié)果均在EPA方法設(shè)定的范圍內(nèi)(EPA方法中的表8)。一些長鏈全氟辛烷磺酸的回收率較低(特別是最后五種化合物)，這與EPA 實驗室間研究1得出的結(jié)果一致。
表3.從樣品中提取的內(nèi)標物(EIS)的回收率(%)(點擊查看大圖)
樣品S2和S7的回收率與S1相似，因此此處未顯示其數(shù)據(jù)。
方法準確度：加標樣品中目標PFAS的回收率
方法準確度可通過加標樣品的分析物回收率(LFM)進行評估。如表4所示，LFM樣品的PFAS 回收率結(jié)果在EPA方法設(shè)定的范圍內(nèi)(EPA方法中的表7)。PFDOs的回收率較低，可能是由于缺乏同位素標記的內(nèi)標物(13C8-PFOS用于該方法中的定量)。EPA的實驗室間研究也獲得了同樣低的結(jié)果。1
測量的RSD%的精密度在20%以內(nèi)(n≥3)。此外，使用從Absolute Standards Inc.獲得的能力驗證樣品進一步驗證了該方法的準確性，所有40種PFAS的結(jié)果均在可接受范圍內(nèi)(數(shù)據(jù)未顯示，但可根據(jù)要求提供)。
表4.加標現(xiàn)場樣品中目標全氟辛烷磺酸的回收率(點擊查看大圖)
*注：空格的PFAS值
3 樣品分析
通過本研究開發(fā)的工作流程，收集并測量了11個樣品的全氟辛烷磺酸含量。樣品S1(沙子)、S6(人類糞便)、S10(韭菜)和S11(豬血)的全氟辛烷磺酸水平均低于該方法的定量限。如表5所列，從多倫多安大略湖沿岸不同海灘地區(qū)采集的兩份沉積物樣本(S2和S7)中僅檢測出了全氟辛烷磺酸。在我家后院的土壤(S4)中發(fā)現(xiàn)了三種PFAS分析物(PFOS 、PFOA 和PFHPA)，在多倫多Mimico-Creek地區(qū)采集的污泥樣品(S3)中發(fā)現(xiàn)了七種PFAS化合物，從花園商店購買的黑色花園土壤(S5)中檢測到了十二種PFAS化合物。
表5.不同固體樣品的全氟辛烷磺酸結(jié)果(ng/G)及其IAR值(點擊查看大圖)
我驚訝地發(fā)現(xiàn)黑土中竟然有這么多全氟和多氟烷基物質(zhì)(PFAS)，因為我曾用在這塊地里種植過一種很受歡迎的蔬菜(S10韭菜)。幸運的是，在這個蔬菜樣本中沒有發(fā)現(xiàn)PFAS。圖3顯示了在黑土樣品中發(fā)現(xiàn)的PFAS的LC-MS/MS色譜圖。如表6所示，從兩個生物固體樣品中發(fā)現(xiàn)了八種PFAS化合物(主要是長鏈全氟辛烷磺酸化合物)。我們的結(jié)果與最近對加拿大廢水和生物固體樣品中PFAS的研究結(jié)果一致8。
圖3.黑色花園土壤樣品中發(fā)現(xiàn)的全氟辛烷磺酸的LC-MS/MS色譜圖(點擊查看大圖)
表6.生物固體樣品的全氟辛烷磺酸結(jié)果(ng/g)和IAR值(點擊查看大圖)
盡管加拿大自21世紀初就開始對PFAS進行管制并逐步停止生產(chǎn)，但由于其在環(huán)境中的持久性，仍然在大多數(shù)樣本中檢測到了PFAS 。
結(jié)論
我們開發(fā)了一種靈敏且可靠的分析方法，用于分析低ng/L水平的固體和生物固體樣品中的40種PFAS。該方法采用自動固相萃取 （SPE）樣品預處理方法結(jié)合QSight LC-MS/MS進行分析。使用更大的內(nèi)徑SPP UHPLC柱并向柱中注入更多樣品，可以實現(xiàn)更好的分離、更高的靈敏度和更穩(wěn)健的方法。使用雙層SPE小柱(WAX/GCB)不僅能簡化樣品制備的步驟，節(jié)約時間，還能提高分析物回收率和準確率。均符合EPA 1633的所有性能標準，這表明該方法具有同等性，用于實際水樣分析也具有良好的精密度和準確度。
致謝
作者衷心感謝加拿大環(huán)境與氣候變化部科技處的Shirley Anne Smyth博士，是她為我們提供了生物固體樣本以供測試之用。
參考文獻
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