面對(duì)小分子發(fā)現(xiàn)、多組學(xué)研究、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物制藥分析中日益復(fù)雜的樣本與表征需求，全新推出的Thermo Scientific™ Orbitrap™ Tribrid™ Apex質(zhì)譜系統(tǒng)以更強(qiáng)的多功能性、性能與易用性，幫助科研人員拓展解析邊界。該平臺(tái)中融合了先進(jìn)離子控制、靈活MSn工作流，以及多種不同的正交碎裂方式，可為小分子化合物、蛋白質(zhì)、代謝物、脂質(zhì)、寡核苷酸及大分子復(fù)合物等多類型目標(biāo)分子提供更深入的結(jié)構(gòu)信息。借助多項(xiàng)可現(xiàn)場(chǎng)升級(jí)的內(nèi)容，Orbitrap Tribrid Apex可伴隨研究方向持續(xù)演進(jìn)，為復(fù)雜樣本的精準(zhǔn)鑒定、定量和結(jié)構(gòu)解析提供面向未來的一體化質(zhì)譜解決方案。
創(chuàng)新點(diǎn)
紅外激光
新增 IR 激光輔助碎裂，可正交使用 IRMPD(紅外多光子解離)，也可結(jié)合ETD等方式，提高碎裂效率進(jìn)一步提高譜圖質(zhì)量。適用于TMT定量分析、翻譯后修飾分析、大分子天然結(jié)構(gòu)溫和脫溶劑、topdown分析等。
DMT直接質(zhì)量分析模式
新增直接質(zhì)量分析的DMT模式，可在單離子情況下同時(shí)獲取 m/z和z值信息，可在MS1 和 MSn級(jí)別使用。適用于膜蛋白、糖蛋白、蛋白復(fù)合物等的全面表征。
進(jìn)一步擴(kuò)展 Native MS 選項(xiàng)
Orbitrap MSn 檢測(cè)范圍拓展至 m/z 20,000，四極桿隔離范圍最高可達(dá) m/z 12,000。適用于非變性情況下分析大分子復(fù)合物和蛋白質(zhì)組裝體等。
掃描速度提升
得益于掃描矩陣執(zhí)行機(jī)制的優(yōu)化，DIA 和 DDA 的Orbitrap MS² 采集速率最高可達(dá) 75 Hz，基于離子阱的 MSn采集速率最高可達(dá) 100 Hz。
智能靶向TMT數(shù)據(jù)采集
可結(jié)合Adaptive RT 功能和實(shí)時(shí)譜圖庫檢索RTLS，以及IRMPD碎裂模式，構(gòu)建高通量的靶向 TMT 定量分析的端到端工作流程。
至此，大家一定很關(guān)心Orbitrap Tribrid Apex 在不同領(lǐng)域的應(yīng)用性能，下面就給大家分享一些具體的應(yīng)用實(shí)例。
快速極性切換非靶向代謝組分析
以 6 種茶葉提取物為樣品，建立短梯度單次進(jìn)樣正負(fù)極性切換 LC-MS 方法。
分辨率相同時(shí)，使用極性切換，5min梯度中，IQ-X單個(gè)色譜峰僅有 3 個(gè)點(diǎn)，Apex單個(gè)色譜峰可獲得超過6 個(gè)點(diǎn)。MS1 掃描總數(shù) Apex 比 IQ-X 多出300多張，提升約50%。最終，Apex 5min短梯度即可獲得IQ-X 15min 長(zhǎng)梯度可注釋化合物的 60%~73%，色譜時(shí)長(zhǎng)縮短 66%。該工作流適用于高通量非靶向代謝組、脂質(zhì)組大批量樣本檢測(cè)。
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未知代謝物結(jié)構(gòu)解析
未知物 m/z=217.1183，該物質(zhì)無直接匹配，經(jīng)實(shí)時(shí)譜圖庫檢索RTLS得到L-茶氨酸(m/z 175.1078)為最優(yōu)相似物。儀器自動(dòng)對(duì)共有匹配碎片 m/z 158.0817、獨(dú)有碎片 m/z 112.0757分別采集MS³。MS³譜圖比對(duì)證實(shí)二者共享特征亞結(jié)構(gòu)，證明未知物與茶氨酸骨架相近。僅依靠MS²的碎片，兩種候選結(jié)構(gòu) FISh 打分結(jié)果模糊，疊加未知碎片的MS³數(shù)據(jù)后，可直接排除錯(cuò)誤候選結(jié)構(gòu)式，鎖定結(jié)構(gòu)。
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RTLS 結(jié)合 ddMS³(數(shù)據(jù)依賴多級(jí)質(zhì)譜)策略，基于 mzCloud 譜庫實(shí)時(shí)相似度檢索，是未知代謝物高效定性的可行方案：通過匹配/非匹配雙碎片 MS³ 采集，明確未知物與已知物共有骨架及獨(dú)有結(jié)構(gòu)，高效精簡(jiǎn)候選結(jié)構(gòu)式，突破代謝組未知物鑒定瓶頸。
SQUAD 并行采集進(jìn)行血漿未知代謝物定性篩選與目標(biāo)化合物精準(zhǔn)定量
NIST SRM 1950 人血漿基質(zhì)，摻入梯度濃度的同位素標(biāo)記氨基酸。使用SQUAD方法，對(duì)比 IQ-X，Apex可實(shí)現(xiàn)苯丙氨酸柱上LLOQ 0.5 fmol，靈敏度提升10 倍，且線性動(dòng)態(tài)范圍拓寬至7 個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)，相較 IQ-X，Apex的一級(jí)二級(jí)譜圖數(shù)均得到了大幅增加，可注釋代謝物總數(shù)提升40%左右。單針進(jìn)樣融合靶向 + 非靶向兩種策略，既能精準(zhǔn)定量目標(biāo)代謝物，又可后續(xù)回溯挖掘全譜未知代謝變化，兼顧定量精確度與廣譜篩選能力。
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TMT非靶向定量及定量靶向驗(yàn)證
憑借優(yōu)化的離子并行性與IR輔助碎裂，Orbitrap Tribrid Apex 可提升TMT分析性能，增強(qiáng)報(bào)告離子信號(hào)，多肽定量與目標(biāo)覆蓋度，實(shí)現(xiàn)更可靠的多重分析。比較采用HCD和IRMPD碎裂發(fā)現(xiàn)后者可獲得更高的TMT報(bào)告離子信號(hào)，對(duì)比 Ascend，可獲得18%的定量多肽數(shù)目提升。結(jié)合Adaptive RT 和實(shí)時(shí)譜圖庫檢索RTLS及IRMPD，可比HCD方式定量覆蓋度提升2.4倍。
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建立Neo-SCOAD新抗原同步驗(yàn)證與挖掘流程
比較HCD和EThcD碎裂方式：兩種碎裂鑒定的肽段數(shù)重合率為44%，無方法偏向性，二者鑒定結(jié)果互為補(bǔ)充。兩種碎裂得到的 HLA 等位基因歸屬、肽結(jié)合特征基序完全一致，碎裂方法不改變抗原生物學(xué)特征。但EThcD 在每個(gè)肽骨架斷裂位點(diǎn)產(chǎn)生更多碎片離子，且高置信度序列(CAA>80%)肽段數(shù)量是 HCD 方式下的2倍。
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Neo-SCOAD 一體化方法：融合 DDA 非靶向未知肽發(fā)現(xiàn) + tMS2靶向候選新抗原精準(zhǔn)分析。由于無靶向采集占用掃描周期，常規(guī)DDA 方法肽鑒定總數(shù)更高，但 Neo-SCOAD 依托 EThcD 大幅提升目標(biāo)新抗原序列可靠性，精準(zhǔn)解析目標(biāo)肽 b/y、c/z離子碎片。
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Neo-SCOAD 技術(shù)整合靶向與非靶向工作流，在拓展免疫肽組檢測(cè)廣度的同時(shí)，精準(zhǔn)提升候選免疫治療靶點(diǎn)(新抗原)可靠性。
DMT 模式在完整蛋白和topdown水平的應(yīng)用
使用Aquaporin Z膜蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)：非變性條件下，利用DMT模式，可清晰解析膜蛋白與不同數(shù)量分子的非共價(jià)結(jié)合狀態(tài)，且可對(duì)該四聚體蛋白復(fù)合物(分子量近100kDa)實(shí)現(xiàn)同位素分辨分析。
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Topdown分析：結(jié)合DMT模式與不同的碎裂方式，可實(shí)現(xiàn)碳酸酐酶 88%的序列覆蓋率，而未使用DMT模式時(shí)，只能獲得約40%的序列覆蓋度。這是由于DMT模式可以更好地解析蛋白中段的大片段，從而實(shí)現(xiàn)更高的序列覆蓋度。
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定量交聯(lián)質(zhì)譜 (XL-MS) 分析
使用DSSO 交聯(lián)的 HEK293 細(xì)胞蛋白，并進(jìn)行TMT11plex標(biāo)記。相較Orbitrap Ascend 質(zhì)譜，Orbitrap Tribrid Apex 可鑒定的交聯(lián)肽段對(duì)(XLs)、交聯(lián)譜圖 (CSM)、及可定量的交聯(lián)肽段對(duì)提升約 15%。對(duì)比 HCD碎裂，新增的IRMPD碎裂，獲得的TMT 報(bào)告離子信號(hào)提升 3 倍，大幅減少定量通道缺失，改善多通道 TMT 準(zhǔn)確定量。經(jīng)優(yōu)化后的 MS2-MS3(IRMPD 碎裂)方案可作為 TMT 定量交聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)選采集方法，可高效實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)全蛋白組水平互作定量分析。
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單氨基酸殘基分辨率水平的HDX-MS分析
使用模型肽段P1評(píng)估不同碎裂方式在HDX-MS分析中的氘重排率，并優(yōu)化儀器內(nèi)部各個(gè)主要參數(shù)觀察其對(duì)氘重排率的影響，并建立一鍵式校正程序，可簡(jiǎn)化單氨基酸殘基分辨率水平的HDX-MS分析。
ETD/EThcD：+3價(jià)母離子ETD 碎裂產(chǎn)生的平均氘重排率約10%，當(dāng)輔助的HCD 碎裂能量在40%以內(nèi)時(shí)，不會(huì)額外加劇氘重排。
IR-ETD/IR-EThcD：紅外激光功率小于8% 時(shí)，+3 價(jià)母離子氘重排率穩(wěn)定在 10%；功率超過10% 后重排率顯著上升。結(jié)合IR和ETD可提高碎裂效率，提升肽段碎片信噪比與序列覆蓋率。
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結(jié)合DMT模式的抗體亞基middle-down分析
直接質(zhì)量分析技術(shù)DMT模式可從復(fù)雜的top-down和middle-down譜圖中獲取質(zhì)量域信息，可有效提高序列覆蓋度，尤其是傳統(tǒng)方法難以解卷積的蛋白質(zhì)序列的中段。結(jié)合DMT模式，抗體的輕鏈及Fd區(qū)域均可以實(shí)現(xiàn)超過70%的序列覆蓋度，且實(shí)現(xiàn)CDR區(qū)域的可靠表征。
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低豐度翻譯后修飾的精準(zhǔn)表征與定量分析
抗體CDR區(qū)天冬氨酸異構(gòu)化對(duì)結(jié)合活性有很大影響，肽段 VVSVLTVLHQDWLDGKEYK同時(shí)發(fā)生了天冬氨酸異構(gòu)化及脫酰胺，相對(duì)豐度只有0.25%，仍可進(jìn)行表征與定量。其中，天冬氨酸異構(gòu)化的肽段在HCD碎裂時(shí)無特征碎片，借助IR-ETD 產(chǎn)生的c+57、z-57特征碎片離子，可準(zhǔn)確區(qū)分天冬氨酸(Asp)和異天冬氨酸(isoAsp)。
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tRNA的全面表征
單個(gè)平臺(tái)中進(jìn)行tRNA的完整分子量分析，自上而下分析和序列匹配。對(duì)CHO細(xì)胞的Tyr-tRNA進(jìn)行完整分子量分析，質(zhì)量偏差小于3ppm，同時(shí)可鑒定多種雜質(zhì)。自上而下分析可獲得豐富的碎片離子，實(shí)現(xiàn)可靠測(cè)序。在序列匹配中，使用lowQ-CID碎裂方式實(shí)現(xiàn)接近100%序列覆蓋度。
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結(jié)語
Orbitrap Tribrid Apex不僅是一臺(tái)高性能質(zhì)譜儀，更是面向復(fù)雜樣本深度解析的綜合分析平臺(tái)。憑借靈活的MSn工作流，多種正交碎裂方式，質(zhì)量范圍拓展，直接質(zhì)量分析技術(shù)等，Apex能夠覆蓋小分子、多組學(xué)、生物制藥和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等多類應(yīng)用場(chǎng)景，幫助研究者從復(fù)雜數(shù)據(jù)中獲取更豐富，更可信的分子信息。
從未知物鑒定到結(jié)構(gòu)表征，從定性分析到定量研究，Orbitrap Tribrid Apex 為前沿質(zhì)譜研究提供了面向未來的技術(shù)支撐。
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