面對小分子發(fā)現(xiàn)、多組學研究、結構生物學和生物制藥分析中日益復雜的樣本與表征需求，全新推出的Thermo Scientific™ Orbitrap™ Tribrid™ Apex質(zhì)譜系統(tǒng)以更強的多功能性、性能與易用性，幫助科研人員拓展解析邊界。該平臺中融合了先進離子控制、靈活MSn工作流，以及多種不同的正交碎裂方式，可為小分子化合物、蛋白質(zhì)、代謝物、脂質(zhì)、寡核苷酸及大分子復合物等多類型目標分子提供更深入的結構信息。借助多項可現(xiàn)場升級的內(nèi)容，Orbitrap Tribrid Apex可伴隨研究方向持續(xù)演進，為復雜樣本的精準鑒定、定量和結構解析提供面向未來的一體化質(zhì)譜解決方案。
創(chuàng)新點
紅外激光
新增 IR 激光輔助碎裂，可正交使用 IRMPD(紅外多光子解離)，也可結合ETD等方式，提高碎裂效率進一步提高譜圖質(zhì)量。適用于TMT定量分析、翻譯后修飾分析、大分子天然結構溫和脫溶劑、topdown分析等。
DMT直接質(zhì)量分析模式
新增直接質(zhì)量分析的DMT模式，可在單離子情況下同時獲取 m/z和z值信息，可在MS1 和 MSn級別使用。適用于膜蛋白、糖蛋白、蛋白復合物等的全面表征。
進一步擴展 Native MS 選項
Orbitrap MSn 檢測范圍拓展至 m/z 20,000，四極桿隔離范圍最高可達 m/z 12,000。適用于非變性情況下分析大分子復合物和蛋白質(zhì)組裝體等。
掃描速度提升
得益于掃描矩陣執(zhí)行機制的優(yōu)化，DIA 和 DDA 的Orbitrap MS² 采集速率最高可達 75 Hz，基于離子阱的 MSn采集速率最高可達 100 Hz。
智能靶向TMT數(shù)據(jù)采集
可結合Adaptive RT 功能和實時譜圖庫檢索RTLS，以及IRMPD碎裂模式，構建高通量的靶向 TMT 定量分析的端到端工作流程。
至此，大家一定很關心Orbitrap Tribrid Apex 在不同領域的應用性能，下面就給大家分享一些具體的應用實例。
快速極性切換非靶向代謝組分析
以 6 種茶葉提取物為樣品，建立短梯度單次進樣正負極性切換 LC-MS 方法。
分辨率相同時，使用極性切換，5min梯度中，IQ-X單個色譜峰僅有 3 個點，Apex單個色譜峰可獲得超過6 個點。MS1 掃描總數(shù) Apex 比 IQ-X 多出300多張，提升約50%。最終，Apex 5min短梯度即可獲得IQ-X 15min 長梯度可注釋化合物的 60%~73%，色譜時長縮短 66%。該工作流適用于高通量非靶向代謝組、脂質(zhì)組大批量樣本檢測。
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未知代謝物結構解析
未知物 m/z=217.1183，該物質(zhì)無直接匹配，經(jīng)實時譜圖庫檢索RTLS得到L-茶氨酸(m/z 175.1078)為最優(yōu)相似物。儀器自動對共有匹配碎片 m/z 158.0817、獨有碎片 m/z 112.0757分別采集MS³。MS³譜圖比對證實二者共享特征亞結構，證明未知物與茶氨酸骨架相近。僅依靠MS²的碎片，兩種候選結構 FISh 打分結果模糊，疊加未知碎片的MS³數(shù)據(jù)后，可直接排除錯誤候選結構式，鎖定結構。
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RTLS 結合 ddMS³(數(shù)據(jù)依賴多級質(zhì)譜)策略，基于 mzCloud 譜庫實時相似度檢索，是未知代謝物高效定性的可行方案：通過匹配/非匹配雙碎片 MS³ 采集，明確未知物與已知物共有骨架及獨有結構，高效精簡候選結構式，突破代謝組未知物鑒定瓶頸。
SQUAD 并行采集進行血漿未知代謝物定性篩選與目標化合物精準定量
NIST SRM 1950 人血漿基質(zhì)，摻入梯度濃度的同位素標記氨基酸。使用SQUAD方法，對比 IQ-X，Apex可實現(xiàn)苯丙氨酸柱上LLOQ 0.5 fmol，靈敏度提升10 倍，且線性動態(tài)范圍拓寬至7 個數(shù)量級。同時，相較 IQ-X，Apex的一級二級譜圖數(shù)均得到了大幅增加，可注釋代謝物總數(shù)提升40%左右。單針進樣融合靶向 + 非靶向兩種策略，既能精準定量目標代謝物，又可后續(xù)回溯挖掘全譜未知代謝變化，兼顧定量精確度與廣譜篩選能力。
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TMT非靶向定量及定量靶向驗證
憑借優(yōu)化的離子并行性與IR輔助碎裂，Orbitrap Tribrid Apex 可提升TMT分析性能，增強報告離子信號，多肽定量與目標覆蓋度，實現(xiàn)更可靠的多重分析。比較采用HCD和IRMPD碎裂發(fā)現(xiàn)后者可獲得更高的TMT報告離子信號，對比 Ascend，可獲得18%的定量多肽數(shù)目提升。結合Adaptive RT 和實時譜圖庫檢索RTLS及IRMPD，可比HCD方式定量覆蓋度提升2.4倍。
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建立Neo-SCOAD新抗原同步驗證與挖掘流程
比較HCD和EThcD碎裂方式：兩種碎裂鑒定的肽段數(shù)重合率為44%，無方法偏向性，二者鑒定結果互為補充。兩種碎裂得到的 HLA 等位基因歸屬、肽結合特征基序完全一致，碎裂方法不改變抗原生物學特征。但EThcD 在每個肽骨架斷裂位點產(chǎn)生更多碎片離子，且高置信度序列(CAA>80%)肽段數(shù)量是 HCD 方式下的2倍。
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Neo-SCOAD 一體化方法：融合 DDA 非靶向未知肽發(fā)現(xiàn) + tMS2靶向候選新抗原精準分析。由于無靶向采集占用掃描周期，常規(guī)DDA 方法肽鑒定總數(shù)更高，但 Neo-SCOAD 依托 EThcD 大幅提升目標新抗原序列可靠性，精準解析目標肽 b/y、c/z離子碎片。
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Neo-SCOAD 技術整合靶向與非靶向工作流，在拓展免疫肽組檢測廣度的同時，精準提升候選免疫治療靶點(新抗原)可靠性。
DMT 模式在完整蛋白和topdown水平的應用
使用Aquaporin Z膜蛋白標準品進行結合實驗：非變性條件下，利用DMT模式，可清晰解析膜蛋白與不同數(shù)量分子的非共價結合狀態(tài)，且可對該四聚體蛋白復合物(分子量近100kDa)實現(xiàn)同位素分辨分析。
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Topdown分析：結合DMT模式與不同的碎裂方式，可實現(xiàn)碳酸酐酶 88%的序列覆蓋率，而未使用DMT模式時，只能獲得約40%的序列覆蓋度。這是由于DMT模式可以更好地解析蛋白中段的大片段，從而實現(xiàn)更高的序列覆蓋度。
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定量交聯(lián)質(zhì)譜 (XL-MS) 分析
使用DSSO 交聯(lián)的 HEK293 細胞蛋白，并進行TMT11plex標記。相較Orbitrap Ascend 質(zhì)譜，Orbitrap Tribrid Apex 可鑒定的交聯(lián)肽段對(XLs)、交聯(lián)譜圖 (CSM)、及可定量的交聯(lián)肽段對提升約 15%。對比 HCD碎裂，新增的IRMPD碎裂，獲得的TMT 報告離子信號提升 3 倍，大幅減少定量通道缺失，改善多通道 TMT 準確定量。經(jīng)優(yōu)化后的 MS2-MS3(IRMPD 碎裂)方案可作為 TMT 定量交聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)選采集方法，可高效實現(xiàn)細胞內(nèi)全蛋白組水平互作定量分析。
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單氨基酸殘基分辨率水平的HDX-MS分析
使用模型肽段P1評估不同碎裂方式在HDX-MS分析中的氘重排率，并優(yōu)化儀器內(nèi)部各個主要參數(shù)觀察其對氘重排率的影響，并建立一鍵式校正程序，可簡化單氨基酸殘基分辨率水平的HDX-MS分析。
ETD/EThcD：+3價母離子ETD 碎裂產(chǎn)生的平均氘重排率約10%，當輔助的HCD 碎裂能量在40%以內(nèi)時，不會額外加劇氘重排。
IR-ETD/IR-EThcD：紅外激光功率小于8% 時，+3 價母離子氘重排率穩(wěn)定在 10%；功率超過10% 后重排率顯著上升。結合IR和ETD可提高碎裂效率，提升肽段碎片信噪比與序列覆蓋率。
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結合DMT模式的抗體亞基middle-down分析
直接質(zhì)量分析技術DMT模式可從復雜的top-down和middle-down譜圖中獲取質(zhì)量域信息，可有效提高序列覆蓋度，尤其是傳統(tǒng)方法難以解卷積的蛋白質(zhì)序列的中段。結合DMT模式，抗體的輕鏈及Fd區(qū)域均可以實現(xiàn)超過70%的序列覆蓋度，且實現(xiàn)CDR區(qū)域的可靠表征。
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低豐度翻譯后修飾的精準表征與定量分析
抗體CDR區(qū)天冬氨酸異構化對結合活性有很大影響，肽段 VVSVLTVLHQDWLDGKEYK同時發(fā)生了天冬氨酸異構化及脫酰胺，相對豐度只有0.25%，仍可進行表征與定量。其中，天冬氨酸異構化的肽段在HCD碎裂時無特征碎片，借助IR-ETD 產(chǎn)生的c+57、z-57特征碎片離子，可準確區(qū)分天冬氨酸(Asp)和異天冬氨酸(isoAsp)。
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tRNA的全面表征
單個平臺中進行tRNA的完整分子量分析，自上而下分析和序列匹配。對CHO細胞的Tyr-tRNA進行完整分子量分析，質(zhì)量偏差小于3ppm，同時可鑒定多種雜質(zhì)。自上而下分析可獲得豐富的碎片離子，實現(xiàn)可靠測序。在序列匹配中，使用lowQ-CID碎裂方式實現(xiàn)接近100%序列覆蓋度。
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結語
Orbitrap Tribrid Apex不僅是一臺高性能質(zhì)譜儀，更是面向復雜樣本深度解析的綜合分析平臺。憑借靈活的MSn工作流，多種正交碎裂方式，質(zhì)量范圍拓展，直接質(zhì)量分析技術等，Apex能夠覆蓋小分子、多組學、生物制藥和結構生物學等多類應用場景，幫助研究者從復雜數(shù)據(jù)中獲取更豐富，更可信的分子信息。
從未知物鑒定到結構表征，從定性分析到定量研究，Orbitrap Tribrid Apex 為前沿質(zhì)譜研究提供了面向未來的技術支撐。
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