高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，簡稱 HPLC)是分析實驗室里最常見的一類分離分析技術(shù)。它的用途可以概括成一句話：把混合物里的各種成分分開，然后逐個定性和定量。與氣相色譜相比，液相色譜不要求樣品能夠氣化，因此更適合處理高沸點、不易揮發(fā)、受熱易分解以及分子量較大的化合物。在藥物分析、食品檢測、環(huán)境監(jiān)測和生命科學等領(lǐng)域，它是一項基礎(chǔ)性的常規(guī)手段。

　　一、分離是怎么發(fā)生的

　　液相色譜的分離依賴于兩相之間的分配差異。一相是固定相，通常是裝在色譜柱里的固體吸附劑或鍵合在載體表面的官能團;另一相是流動相，即被泵推動著流過色譜柱的液體溶劑。樣品被注入流動相后，隨流動相進入色譜柱。由于樣品中各組分與固定相的相互作用強弱不同，它們在兩相間反復進行吸附—解吸的分配過程。與固定相作用強的組分停留時間長、移動慢;作用弱的組分停留時間短、移動快。經(jīng)過足夠多次的分配，原本微小的遷移速度差異被放大，各組分便先后離開色譜柱，形成一個個彼此分開的譜帶。

　　組分從進樣到流出色譜柱所需的時間稱為保留時間。在固定的色譜條件下，同一種物質(zhì)有相對穩(wěn)定的保留時間，這是定性分析的依據(jù);檢測器給出的信號強度(通常表現(xiàn)為色譜峰的面積或峰高)則與物質(zhì)的量相關(guān)，是定量分析的依據(jù)。

　　從理論上說，色譜柱的分離效率常用理論塔板數(shù)衡量。柱效與填料粒徑直接相關(guān)：粒徑越小，傳質(zhì)路徑越短，譜帶展寬越小，柱效越高。早期的高效液相色譜柱效在每米 6 萬至 10 萬塊塔板，采用 1.7 微米多孔顆粒的超高效液相色譜出現(xiàn)后，柱效提升到每米 25 萬塊塔板左右。

　　二、儀器的基本構(gòu)成

　　一套完整的液相色譜系統(tǒng)由幾個模塊串聯(lián)而成：儲液瓶、高壓輸液泵、進樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

　　輸液泵是系統(tǒng)的動力源，負責以穩(wěn)定的流速把流動相送入色譜柱。液體的黏度遠大于氣體，要讓液體以合理流速穿過裝填了微米級顆粒的柱子，需要相當高的壓力。早期儀器的操作壓力約 500 psi(約 35 bar)，因此這項技術(shù)最初被稱為"高壓液相色譜";隨著填料變細、柱效提升，現(xiàn)代常規(guī)系統(tǒng)的壓力上限一般在 400 bar(約 6000 psi)上下，名稱也隨之改為"高效液相色譜"。流速的穩(wěn)定性和梯度的準確性直接決定保留時間的重現(xiàn)性。

　　進樣系統(tǒng)把微升級別的樣品溶液準確地引入流動相流路?，F(xiàn)代儀器普遍配備自動進樣器，可以連續(xù)處理批量樣品，減少人為誤差，提高重復性。

　　色譜柱是整個系統(tǒng)的核心，分離在這里發(fā)生。柱管多為不銹鋼材質(zhì)，內(nèi)部裝填顆粒狀固定相。常見的分析柱內(nèi)徑為 4.6 毫米，長度在 15 厘米左右;與質(zhì)譜聯(lián)用時，常采用 2.1 毫米內(nèi)徑的細柱以適配較低流速。

　　檢測器把流出色譜柱的組分濃度轉(zhuǎn)換成電信號。紫外—可見檢測器和二極管陣列檢測器應用廣，適用于有紫外吸收的化合物;熒光檢測器靈敏度更高，適合能發(fā)熒光的物質(zhì)或經(jīng)衍生化后發(fā)熒光的物質(zhì);示差折光檢測器屬于通用型，但靈敏度較低且不適合梯度洗脫;電化學檢測器用于具有氧化還原活性的物質(zhì);質(zhì)譜檢測器則能提供分子量與結(jié)構(gòu)信息，選擇性強。

　　數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)由計算機和色譜工作站軟件構(gòu)成，負責采集信號、繪制色譜圖、積分峰面積并輸出報告。

　　三、幾種常見的分離模式

　　按分離機制劃分，液相色譜有幾種常用模式。

　　反相色譜是目前應用較廣的一種。固定相是非極性的(典型代表是在硅膠表面鍵合 C18 烷基鏈)，流動相是極性的(如水與甲醇或乙腈的混合溶液)。極性大的組分與固定相作用弱，先流出;極性小的組分保留更強，后流出。絕大多數(shù)有機小分子藥物都可用反相色譜分析。

　　正相色譜與之相反，固定相為極性(如硅膠、氨基鍵合相)，流動相為非極性有機溶劑，適合分離極性較強或幾何異構(gòu)的化合物。

　　離子交換色譜的固定相帶有可交換的離子基團，依靠樣品離子與固定相之間的靜電作用強弱實現(xiàn)分離，常用于無機離子、有機酸、有機堿以及蛋白質(zhì)、核酸等帶電生物大分子的分析。

　　體積排阻色譜(也稱凝膠色譜)按分子在溶液中的流體力學體積大小分離。固定相是多孔凝膠，孔徑有一定分布。分子體積大的無法進入孔道，只能沿顆粒間隙流動，路徑短，先流出;分子體積小的可以進入孔道，路徑長，后流出。該模式常用于測定聚合物的分子量分布，或作為蛋白質(zhì)分離的輔助手段。

　　親和色譜利用生物分子之間的專一性相互作用，如抗原與抗體、酶與底物、受體與配體。它的選擇性高，在抗體藥物分析中應用較多。

　　此外還有親水作用色譜(HILIC)、手性色譜等特殊模式，用于強極性化合物和對映異構(gòu)體的分離。

　　四、等度洗脫與梯度洗脫

　　按流動相組成在運行過程中是否變化，洗脫分為兩種方式。

　　等度洗脫在整個分析過程中流動相組成保持不變，例如恒定比例的乙腈—水混合溶液。這種方式操作簡單、基線穩(wěn)定、平衡快，適合組分較少、保留差異不大的樣品。

　　梯度洗脫在運行過程中按設定程序改變流動相組成，通常是逐步提高有機相或洗脫能力較強的溶劑的比例。對于組分復雜、極性跨度大的樣品，等度洗脫往往會出現(xiàn)"弱保留組分擠在一起、強保留組分遲遲不出峰"的問題;梯度洗脫可以讓先出的組分在較弱的洗脫條件下分開，同時把強保留組分更快地推下來，縮短總分析時間并改善峰形。代價是每次運行結(jié)束后需要用初始流動相重新平衡色譜柱，且基線容易受溶劑純度與混合均勻性的影響。

　　五、色譜柱與填料

　　填料是決定分離性能的關(guān)鍵?；仡櫰溲葑儯?0 世紀 70 年代主流是 10 微米不規(guī)則顆粒;70 年代末 5 微米球形顆粒因傳質(zhì)和裝填性能更好而普及，并在此后長期占主導地位;90 年代中期起，更細的顆粒(小于 2 至 4 微米)開始被使用，到近年其使用比例已超過 5 微米顆粒。

　　粒徑減小帶來兩個結(jié)果：一是柱效提高，因而可以縮短柱長;二是柱壓升高。根據(jù) Kozeny-Carman 關(guān)系，壓力降與粒徑的平方成反比，粒徑減半，柱效翻倍，分離度約提高 40%，但柱壓會升至原來的四倍。這正是超高效液相色譜需要專門的高壓硬件的原因。

　　為緩解這一矛盾，核殼型(表面多孔)填料得到推廣。這類顆粒由實心硅球內(nèi)核和多孔外殼構(gòu)成，粒徑多在 2.6 至 2.7 微米。由于分子只需在外殼薄層內(nèi)擴散，傳質(zhì)路徑短，譜帶展寬小;同時顆粒粒徑分布窄、裝填均勻，柱滲透性好。它可以在遠低于亞 2 微米全多孔填料的壓力下，實現(xiàn)接近后者的柱效，折減板高可低至 1.3 至 1.5，而同尺寸全多孔填料通常在 2.0 以上。這使得普通液相色譜設備也能獲得接近超高壓系統(tǒng)的分離效果，客觀上模糊了 HPLC 與 UHPLC 的界線。

　　填料粒徑的進一步縮小始終受柱壓限制。目前商用超高壓系統(tǒng)的壓力上限多在 1000 至 1500 bar 之間(個別型號可達 1300 bar 甚至 140 MPa)，這構(gòu)成了粒徑可實用化的下限。理論上亞微米顆粒柱效更高，但產(chǎn)生的壓力已超出多數(shù)商用系統(tǒng)的機械承受范圍。

　　六、主要應用領(lǐng)域

　　醫(yī)藥是液相色譜最大的應用領(lǐng)域。藥物研發(fā)、原料藥純度檢查、制劑含量測定、有關(guān)物質(zhì)(雜質(zhì))檢查、溶出度測定、穩(wěn)定性考察都離不開它，各國藥典大量收載液相色譜方法。在藥物質(zhì)量控制實驗室中，液相色譜的使用比例相當高。

　　食品檢測方面，用于食品添加劑(防腐劑、甜味劑、色素)、維生素、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留和生物毒素的測定。

　　環(huán)境監(jiān)測方面，用于地表水、污水和土壤中酚類、多環(huán)芳烴、農(nóng)藥及其他有機污染物的測定。

　　此外，在化工與材料(原料純度、聚合物分析)、臨床檢驗、法醫(yī)鑒定以及高?？蒲兄?，液相色譜同樣屬于常規(guī)配置。

　　七、從 HPLC 到 UHPLC

　　超高效液相色譜(UHPLC)是在 2004 年前后實現(xiàn)商品化的技術(shù)路線。它的做法是：使用亞 2 微米(典型為 1.7 微米)填料，配合能承受 1000 bar 以上壓力的輸液系統(tǒng)、低死體積管路和快速檢測器，從而同時提高分離度、分析速度和靈敏度。公開資料中的對比顯示，在部分手性分離與農(nóng)藥多殘留篩查案例中，分析時間可由 25 至 60 分鐘縮短到 5 至 15 分鐘，溶劑消耗也相應減少。由于分析速度快、溶劑用量少，UHPLC 的初始購置成本雖高于傳統(tǒng)系統(tǒng)，長期運行成本可能更具優(yōu)勢。

　　需要客觀看待的是，UHPLC 并未在原理上改變液相色譜，它對系統(tǒng)死體積、樣品前處理和柱外效應更為敏感，對操作者的維護要求也更高。

　　結(jié)語

　　高效液相色譜是一項成熟但仍在演進的技術(shù)。它的基本思路并不復雜——利用組分在兩相間分配的差異實現(xiàn)分離;但要把它用好，需要在色譜柱、流動相、洗脫程序和檢測器之間做出合理選擇。過去幾十年里，這項技術(shù)的進步主要沿著"更細的填料、更高的壓力、更靈敏的檢測、更智能的控制"幾條線推進。對使用者而言，選擇何種配置最終要回到分析對象本身：樣品的復雜程度、需要的分離度與靈敏度、可接受的通量，以及實驗室現(xiàn)有的設備與成本條件。