蛋白磷酸化是真核細(xì)胞普遍的翻譯后修飾形式，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞過程以及蛋白質(zhì)功能調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。蛋白磷酸化是通過蛋白激酶將三磷酸腺苷(ATP)末端磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上。蛋白激酶的基因突變或異常表達(dá)引起激酶過度激活，從而引發(fā)癌癥及其他疾病。因此，蛋白激酶已成為最重要的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)之一。目前，全球有80余種激酶抑制劑(PKI)獲批上市，還有約180種PKI正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。盡管如此，PKI藥物的研發(fā)仍面臨諸多挑戰(zhàn)，特別是靶點(diǎn)選擇性以及脫靶毒性。目前，PKI的選擇性評(píng)價(jià)主要依賴于數(shù)百種克隆純化的蛋白激酶，或轉(zhuǎn)基因高表達(dá)目標(biāo)激酶的細(xì)胞系。純化的激酶因脫離細(xì)胞環(huán)境，無法真實(shí)反映PKI在細(xì)胞內(nèi)的選擇性；而轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的測(cè)試僅限于預(yù)先設(shè)定的目標(biāo)激酶。針對(duì)這一問題，中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命過程小分子調(diào)控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室康經(jīng)武課題組發(fā)展了一種超深度磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞水平和蛋白組學(xué)層面對(duì)PKI選擇性的全面評(píng)價(jià)。
蛋白磷酸化具有高度動(dòng)態(tài)和低豐度的特點(diǎn)(磷酸化蛋白質(zhì)組僅占總蛋白質(zhì)組的0.1%，而酪氨酸磷酸化蛋白僅占磷酸化蛋白質(zhì)組的 0.1-1%)，因此，磷酸化肽段的富集成為質(zhì)譜分析的關(guān)鍵步驟。為了精確測(cè)量PKI引起的磷酸化事件，在他們發(fā)展的系列微型整體親和色譜柱技術(shù)的基礎(chǔ)上(Anal Chem 2020，92，3913-3922，J Proteome Res 2023，22，2450-2459，Anal. Chem. 2023, 95, 8605-8612)，提出了一種集成三種選擇性互補(bǔ)的磷酸化肽段富集材料的策略，實(shí)現(xiàn)了對(duì)磷酸化肽段的深度全覆蓋和無偏倚的定量分析(圖1)。
圖1. 超深度磷酸化蛋白組分析流程示意圖和磷酸化蛋白組分析數(shù)據(jù)輪廓(點(diǎn)擊查看大圖)
以澤布替尼為模型，在數(shù)據(jù)依賴性質(zhì)譜采集(DDA)數(shù)據(jù)中，檢測(cè)到25種蛋白質(zhì)的25個(gè)磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平顯著上調(diào)，66種蛋白質(zhì)的72個(gè)磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平顯著下調(diào)(其中酪氨酸磷酸化占比為80.9%)；在數(shù)據(jù)非依賴性質(zhì)譜采集(DIA)數(shù)據(jù)中，檢測(cè)到有80種蛋白質(zhì)的91個(gè)磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平顯著上調(diào)，167種蛋白質(zhì)的的磷酸化水平顯著下調(diào)(絕大部分為絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn))(圖2)。
圖2. 超深度磷酸化蛋白組學(xué)分析揭示澤布替尼引起的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的磷酸化事件變化(點(diǎn)擊查看大圖)
圖3.澤布替尼抑制或激活的蛋白激酶及其參與的細(xì)胞過程
(點(diǎn)擊查看大圖)
生物信息學(xué)富集分析表明，除了抑制BCR和FcR信號(hào)通路外，澤布替尼還調(diào)控了B細(xì)胞凋亡、EGFR、ERBB、RPTK以及MAPK級(jí)聯(lián)等信號(hào)通路(圖3)。非常有意思的是，他們的研究發(fā)現(xiàn)澤布替尼不僅抑制了BTK及其下游多個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)通路，還上調(diào)了RAF1、CBL和PTPN11蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而激活了ERK1/2 MAPK介導(dǎo)的BCR信號(hào)通路負(fù)反饋調(diào)控，在BCR信號(hào)通路上游阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。與文獻(xiàn)報(bào)道的澤布替尼的靶點(diǎn)相比，他們發(fā)展的超深度的磷酸化蛋白組學(xué)策略能夠在活細(xì)胞水平，以高通量的方式獲得更豐富的作用靶標(biāo)(或脫靶)信息。通過將磷酸化事件映射到細(xì)胞信號(hào)通路中，可以全景式地揭示澤布替尼的作用機(jī)制(圖4)。
圖4. 通過超深度磷酸化蛋白組學(xué)揭示的澤布替尼可能的分子藥理學(xué)機(jī)制(點(diǎn)擊查看大圖)
總之，超深度磷酸化蛋白組學(xué)分析不僅能以高通量、高靈敏和高置信度的方式在細(xì)胞水平全面評(píng)價(jià)蛋白激酶抑制劑的選擇性，還能通過分析藥物引起的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，揭示PKI更精細(xì)的作用機(jī)理。此外，這一技術(shù)還可廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究。中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所博士生張?jiān)綖檎撐牡谝蛔髡?，中?guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物康經(jīng)武研究員和上?？萍即髮W(xué)組學(xué)分析平臺(tái)的郝丕良研究員為共同通訊作者。感謝賽默飛科技有限公司在Astral分析上的幫助。該工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、中國(guó)科學(xué)院及上海市科委等項(xiàng)目及基金的資助。
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