單細(xì)胞分析的重要性
日益成熟的蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)展到今天，研究人員不斷提出新的需求，其中單細(xì)胞蛋白組分析稱得上是其中的大熱門。應(yīng)用單細(xì)胞技術(shù)，我們可以研究極低樣品量的樣品，可以對(duì)比異質(zhì)性的細(xì)胞或者組織，可以尋找細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育過(guò)程中的變化。但同樣我們也意識(shí)到，其最大的研究難點(diǎn)都集中在這個(gè)“單”字，意味著我們的研究對(duì)象含量極低，不能使用常規(guī)的方法進(jìn)行處理，分析的手段也必須具備更高靈敏度；同樣的，單個(gè)細(xì)胞的分析會(huì)很大程度增加需要分析的樣品數(shù)目，通量的重要性也必須考慮。
說(shuō)到這，去年賽默飛在 ASMS 上發(fā)布的全新一代 Orbitrap Astral 質(zhì)譜儀，兼具高通量高靈敏度深度覆蓋的特點(diǎn)于一身，實(shí)在是非常好的單細(xì)胞蛋白組分析“食用”利器。那么各位單細(xì)胞蛋白組的愛(ài)好者們，請(qǐng)不要錯(cuò)過(guò)接下來(lái)的這份 Orbitrap Astral “食譜”，獲得單個(gè) Hela 細(xì)胞中5000-6500+ 的蛋白鑒定，帶你“品嘗”單細(xì)胞的世界。
Orbitrap Astral TSCP(turbo single cell proteomics) 整體解決方案
來(lái)自丹麥的科研人員在bioRxiv 預(yù)印本上發(fā)表了最新的基于 Astral 的單細(xì)胞蛋白組分析的文章，可以 40 SPD 的通量在單個(gè) Hela 細(xì)胞中獲取超過(guò) 5000 個(gè)蛋白鑒定[1]。因此，我們首先進(jìn)行了一系列的驗(yàn)證工作，確定該方案的性能表現(xiàn)，接著嘗試著做了一些改變，*整體解決方案。
40SPD，單個(gè) Hela 細(xì)胞超過(guò)5000 個(gè)蛋白鑒定[1]
01 單細(xì)胞分離
第一步我們需要獲取單細(xì)胞，而其獲取方式也有好幾種，例如流式細(xì)胞儀分選，微流控技術(shù)、cellenONE、激光輔助顯微切割等。這次我們選用了 cellenONE 體系進(jìn)行單細(xì)胞分離，但如果各位使用其它的方案分離單細(xì)胞，或者使用一些比較大的單細(xì)胞，例如卵細(xì)胞等，可以從第二部分 “單細(xì)胞蛋白組樣品前處理” 開(kāi)始閱讀，同樣適用。
我們選擇了 Hela 細(xì)胞作為分析對(duì)象，分別分離了單個(gè)細(xì)胞，10個(gè)細(xì)胞和20個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的分析。
Hela 單細(xì)胞分離
02 單細(xì)胞蛋白組樣品前處理
由于單個(gè)細(xì)胞蛋白含量極低，其中單個(gè) Hela 細(xì)胞約含 150-600 pg 總蛋白，因此在進(jìn)行樣品前處理時(shí)，需要控制反應(yīng)體系，保證其酶解效率。我們?cè)诹鞒舔?yàn)證中使用了與文獻(xiàn)1一致的 proteoCHIP，并在后續(xù)嘗試使用不同的孔板，96 或 384 孔板的形式，盡可能控制反應(yīng)體系的大小。
樣品前處理過(guò)程[2]如下所示，步驟依次為加入酶解液，分選細(xì)胞，孵育，以及根據(jù)所使用的 proteoCHIP 或者孔板，將樣品轉(zhuǎn)移至 evotip 后上樣或者直接上樣。
單細(xì)胞蛋白組樣品前處理過(guò)程
但如果各位使用其它的方案進(jìn)行樣品前處理，例如使用一些比較大的單細(xì)胞，卵細(xì)胞時(shí)使用 PCR管控制反應(yīng)體系進(jìn)行處理，可以從第三部分 “LC-MS 分析” 開(kāi)始閱讀，同樣適用。
03 LC-MS 分析
不同于常規(guī)上樣量的分析方法，單細(xì)胞蛋白組中通常需要優(yōu)化色譜與質(zhì)譜條件使其更符合低上樣量的樣品，包括但不限于更低的液相流速、使用 FAIMS Pro，延長(zhǎng)二級(jí)離子注入時(shí)間等條件。通常，可以使用稀釋的肽段樣品，模擬單細(xì)胞樣品上樣量獲取優(yōu)化的分析條件，也可將該樣品作為整個(gè)流程的質(zhì)控樣品，檢測(cè)系統(tǒng)狀態(tài)。
如圖所示，F(xiàn)AIMS Pro 接口可有效去除背景噪音，從譜圖中可觀察到更多的肽段信號(hào)，可提高整體的鑒定深度，更有利于少量樣品的分析。因此在后續(xù)分析中均使用了 FAIMS Pro 接口。
單細(xì)胞樣品的 BPC 圖對(duì)比，不加和加載 FAIMS Pro
我們使用稀釋的 Hela 肽段進(jìn)行色譜與質(zhì)譜方法的優(yōu)化，結(jié)果下圖所示。250 pg Hela 肽段可獲得近 6000 蛋白鑒定，近45000 肽段，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]，確證系統(tǒng)狀態(tài)正常。
Hela 肽段不同稀釋上樣量的蛋白和肽段鑒定結(jié)果，數(shù)據(jù)分析使用 directDIA，不同上樣量的樣品之間不做合并分析
04 Orbitrap Astral 單細(xì)胞蛋白組分析性能展示
流程驗(yàn)證結(jié)果：40SPD 時(shí)，單個(gè) Hela 細(xì)胞可獲得 5000+ 蛋白鑒定
首先，我們進(jìn)行了流程驗(yàn)證，將處理后的單細(xì)胞，10個(gè)細(xì)胞和 20 個(gè)細(xì)胞樣品分別上樣，結(jié)果如上圖所示。使用與文獻(xiàn)1一致的流程，通量 40 SPD 時(shí)，Orbitrap Astral在單個(gè) Hela 細(xì)胞中可獲得 5000+ 蛋白鑒定，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，確證了該單細(xì)胞蛋白組分析方案的可行性及儀器性能的穩(wěn)定性。
接著，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，進(jìn)行了一些改變，使用兼容性孔板進(jìn)行單細(xì)胞分離，進(jìn)行樣品前處理后可直接放置在 Vanquish Neo 液相系統(tǒng)中上樣，使用 60 SPD 的方法，結(jié)果可在單個(gè)細(xì)胞中獲得6500+ 蛋白鑒定。
Vanquish Neo + Astral，60SPD 時(shí)，單個(gè) Hela 細(xì)胞可獲得 6500+ 蛋白鑒定
需要我們注意的是，即使是同樣的 Hela 細(xì)胞，不同實(shí)驗(yàn)室、不同傳代次數(shù)、不同直徑大小、等等因素都會(huì)影響到最終的單細(xì)胞蛋白組分析結(jié)果。
另外，如果考慮進(jìn)一步通量的提高，也可以嘗試使用 TMT 等多重通道標(biāo)記試劑的方法。
Orbitrap Astral單細(xì)胞蛋白組分析 “食譜”(整體解決方案)
使用 Orbitrap Astral，單個(gè) Hela 細(xì)胞可獲得中5000-6500+ 的蛋白鑒定，每天完成 60個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)采集，兼顧靈敏度與通量，Turbo speed 實(shí)現(xiàn)高通量，Turbo sensitivity 實(shí)現(xiàn)超高鑒定深度。各位單細(xì)胞蛋白組的愛(ài)好者們，收好這份單細(xì)胞蛋白組分析“食用”指南，一起品嘗單細(xì)胞的世界。
參考文獻(xiàn)
[1] Zilu Ye, Pierre Sabatier, Leander van der Hoeven, Teeradon Phlairaharn, David Hartlmayr, Fabiana Izaguirre, Anjali Seth, Hiren J. Joshi, Dorte B. Bekker-Jensen, Nicolai Bache, Jesper V. Olsen. High-throughput and scalable single cell proteomics identifies over 5000 proteins per cell, bioRxiv preprint doi
[2] proteoCHIP EVO 96 flyer
[3] Julia A. Bubis, Tabiwang N. Arrey, Eugen Damoc, Bernard Delanghe, Jana Slovakova, Theresa M. Sommer, Harunobu Kagawa, Peter Pichler, Nicolas Rivron, Karl Mechtler, Manuel Matzinger. Challenging the AstralTM mass analyzer — going beyond 5200 proteins per single-cell at unseen quantitative 1 accuracy to study cellular heterogeneity, bioRxiv preprint doi.
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