產(chǎn)品名稱：無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒

英文名稱：Endo-Free plasmid mini kit

無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒包裝規(guī)格：

有效期：本產(chǎn)品在常溫(15-25℃) 干燥條件下可保存12個月。

產(chǎn)品原理和特點(diǎn)：

使用無胍鹽質(zhì)粒純化方法，zui高可以獲得高純度的質(zhì)粒50 μg，操作方便；過濾柱除去內(nèi)毒素，使內(nèi)毒素濃度<0.1 EU/µg；沒有鹽離子殘留，提高測序、連接、轉(zhuǎn)化和酶反應(yīng)效率。

使用前準(zhǔn)備事項(xiàng)：

1、使用本產(chǎn)品前，請務(wù)必仔細(xì)閱讀說明書；

2、EFW(70%乙醇)在*使用前加入42 mL無水乙醇，混勻后使用；

3、Buffer RA在*使用前加入RNase A，2-8℃保存。

4、檢查Buffer RB 有無沉淀。如有混濁現(xiàn)象，可在37 ℃水浴中加熱至澄清；

5、全部操作均在室溫進(jìn)行，低溫離心不利于酶去除 RNA；

6、從步驟“10”起，使用新的無內(nèi)毒素的槍頭轉(zhuǎn)移液體并小心操作，可避免引入新的內(nèi)毒素污染物。

操作步驟：

1、取大腸桿菌過夜培養(yǎng)液 1~4 mL，12,000 rpm室溫離心 1 min，棄上清收集菌體。

2、向菌體中加入溶液 RA 200 µL，渦旋振蕩，充分混懸菌體。

*不要?dú)埩艟鷫K，會影響質(zhì)粒得率和純度。

3、加入溶液 RB 200 µL，立即溫和上下顛倒5-7次，使之充分混勻，室溫靜置3 min，形成透明溶液。

*不操作不可劇烈，以免震斷細(xì)菌基因組DNA；也不可超過5 min，以免破壞質(zhì)粒完整性。

4、加入溶液 RC 200 µL，立即溫和地上下顛倒 5~7 次，使之充分混勻。加入100 µL無水乙醇，顛倒混勻。12,000 rpm室溫離心10 min。

5、將上清全部轉(zhuǎn)移至套有過濾柱的結(jié)合柱中。12,000 rpm 室溫離心 2 min，棄濾液。

6、將結(jié)合柱放回，向結(jié)合柱內(nèi)加650 μL 80%乙醇（自備），12,000 rpm室溫離心1 min，棄濾液。

7、將結(jié)合柱放回，12,000 rpm室溫離2 min，除去結(jié)合柱內(nèi)殘留液體。

8、將結(jié)合柱放入新的1.5mL離心管中，敞口室溫放置5~10 min 使乙醇充分揮發(fā)。

*殘留乙醇將嚴(yán)重影響 DNA 洗脫。

9、向結(jié)合中加200 μL Elution Buffer，室溫靜置2~3 min，12,000 rpm室溫離心1 min，棄掉結(jié)合柱。

*將Elution Buffer預(yù)熱至60 ℃左右，可以增加洗脫效率。

10、向洗脫液中加入Buffer RE 200  μL，顛倒混勻，室溫靜置5 min。

11、加入Buffer NE 140 μL，顛倒混勻，并移入Endo-free過濾柱中，靜置5~10 min。12,000 rpm室溫離心2 min，棄過濾柱。

*靜置5~10 min可使絮狀物分層，利于過濾。棄過濾柱前，確認(rèn)無液體殘留，否則再次離心過濾。

12、向?yàn)V液中加入等體積的異丙醇（或者兩倍體積的無水乙醇，自備），顛倒混勻后室溫放置15 min，10,000 rpm離心15 min，棄上清。

13、加入500 μL EFW(70%乙醇)洗滌沉淀，12,000 rpm室溫離心5 min，棄上清。

14、重復(fù)步驟“13”，盡可能棄上清。

15、敞口放置 5~10 min，使乙醇揮發(fā)，用適量EFW溶解沉淀。

常見問題解析：

質(zhì)粒得率低可能原因及解決辦法：

1、菌體未活化，生*率低，菌量少，需要活化菌種；

2、屬于低拷貝質(zhì)粒。增加菌液的量；

3、Buffer RB 裂解不充分。

質(zhì)粒純度差可能原因：

1、未加入RNase A 或RNase A未4 ℃保存；

2、加入Buffer RB 劇烈震蕩，使得基因組斷裂；

3、加入Buffer RC 操作慢，形成微小沉淀，蛋白質(zhì)無法被充分漂洗干凈；

4、OD260/OD280 比值一般在 1.8-2.0 之間，小于 1.8 可能有蛋白污染，大于 2.0 有部分降解或 RNA 污染。