產(chǎn)品名稱：TonkBio無縫克隆試劑盒價格

英文名稱：Toneker Fast-Fusion Cloning Kit   

TonkBio無縫克隆試劑盒價格規(guī)格：

產(chǎn)品組成：

1、Fast-Fusion Enzyme

2、10× Fast-Fusion Buffer

 產(chǎn)品簡介：

Toneclone無縫克隆試劑盒基于DNA序列同源性進行片段重組，可將插入片段PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點。將載體在克隆位點進行線性化，并在插入片段PCR引物5’端引入線性化克隆載體末端序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’zui末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應(yīng)的**的序列 (15 bp～21 bp)。這種兩端帶有載體末端序列的PCR產(chǎn)物和線性化克隆載體按一定比例混合后，在Fast-Fusion Enzyme的催化下，zui快僅需反應(yīng)5 min，即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆?？寺￡栃月士蛇_95%以上。

Toneclone無縫克隆試劑盒價格,報價產(chǎn)品特點：

1、操作簡便：無需考慮酶切點限制；

2、快速重組：15min實現(xiàn)載體和片段的快速重組；

3、效率更高：重組效率為傳統(tǒng)酶切連接技術(shù)的5-10倍，無載體自連現(xiàn)象，陽性克隆可達90%以上。

Toneclone無縫克隆試劑盒價格,報價產(chǎn)品應(yīng)用：

1、PCR產(chǎn)物克隆進載體

2、基因轉(zhuǎn)移

3、在插入片段前后插入adaptor、linker和標(biāo)簽

4、高通量克隆

Toneclone無縫克隆試劑盒價格,報價實驗方案

B．制備線性化載體

環(huán)形載體需要經(jīng)過線性化處理，使載體待重組區(qū)域暴露出來，以供與插入片段進行重組拼接。線性化的方法可以通過限制性內(nèi)切酶酶切或PCR方法實現(xiàn)。若采用酶切進行線性化處理，*進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收，以盡量避免為切割載體在轉(zhuǎn)化后造成假陽性結(jié)果。若PCR擴增得到線性化載體，*使用高保真聚合酶進行擴增，減少PCR體系中的模板用量以減少初始質(zhì)粒造成的假陽性，并在PCR結(jié)束后對產(chǎn)物進行切膠回收或使用DpnI酶消化殘余質(zhì)粒模板。

C. 插入片段的PCR引物設(shè)計

為了實現(xiàn)同源重組，插入片段擴增產(chǎn)物5’和3’末端需要帶有和線性化克隆載體兩個末端對應(yīng)的**的序列（15−21 bp）。下圖以pUC19作為克隆載體為例，設(shè)計引物：

D. 插入片段的PCR擴增

插入片段可選用任何DNA聚合酶進行擴增，Taq DNA聚合酶或其他具有校正活力的高保真酶都可以。若用Taq DNA聚合酶，產(chǎn)物末端的A尾在重組過程中將會被去除，不會因此產(chǎn)生單堿基插入突變。*使用高保真酶進行擴增，以減少在插入片段中引入突變。請在PCR完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳，確認獲得單一條帶的DNA片段。可切膠回收以除去模板、引物、引物二聚體?？赏ㄟ^與已知的DNA分子量marker比較，確定得到的DNA量。

E．重組反應(yīng)體系的建立以及反應(yīng)條件

在冰水浴中，配制如下反應(yīng)體系，將緩沖、水、線性化載體、插入片段加入PCR管中，輕彈混勻，zui后加入酶。

zui適線性化克隆載體與插入片段摩爾比為1:2，可由下列公式粗略計算獲得：

Ø 線性化載體 = [0.01 × 線性化載體長度 (bp)] ng

Ø 插入片段 = [0.01 × 插入片段長度 (bp)] ng

例如將長度500 bp的插入片段克隆到長度2.7 kb的pUC19中，克隆載體的zui適使用量為：0.01×2700=27 ng，插入片段的zui適使用量為：0.02×500=10 ng。

注意：1. 當(dāng)插入片段大于克隆載體時，兩者計算用量公式應(yīng)互換。

2. 線性化載體用量應(yīng)在20−100 ng之間，插入片段擴增產(chǎn)物用量應(yīng)在10−100 ng之間。當(dāng)使用上述公式計算DNA用量超出這個范圍是，請直接選擇zui低/zui高使用量即可。例如插入片段200 bp，zui適用量計算值為4 ng，實際反應(yīng)體系中應(yīng)加入10 ng。

反應(yīng)體系配制完成后，輕彈混勻，并通過短暫離心使其沉到管底，立即放入已預(yù)熱的PCR儀或平衡至所需溫度的水浴中。按下表中方案選其一進行。*在PCR儀中進行反應(yīng)，60°C，15 min。（若選擇在37°C水浴反應(yīng)，請在10 μl反應(yīng)中加入2 μl Fast-Fusion Enzyme。）反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻10 min，然后直接轉(zhuǎn)化。也可選擇−20°C儲存，待需要時，冰上解凍并轉(zhuǎn)化。

F．轉(zhuǎn)化

*使用轉(zhuǎn)化效率≥10⁸ cfu/μg的感受態(tài)細胞，按照對應(yīng)的說明書操作。若轉(zhuǎn)化效率低于10⁸ cfu/μg，可在凃布前將培養(yǎng)的菌液在6000 rpm離心5 min，沉菌用100 μl培養(yǎng)基重懸后，全部涂于對應(yīng)抗性的平板上。過夜培養(yǎng)后，形成數(shù)百個單克隆，可根據(jù)需要選擇PCR或酶切鑒定是否為陽性。

G．常見問題與解決方案