在細(xì)胞的微觀世界里，有兩個(gè)名為YAP和TAZ的“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器”，它們對細(xì)胞的命運(yùn)擁有巨大的影響力。它們能感知細(xì)胞的機(jī)械張力，在組織發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和修復(fù)中扮演關(guān)鍵角色。然而，一旦調(diào)控失衡，這對“搭檔”便會化身“癌變推手”，驅(qū)動腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。YAP/TAZ的信號輸出受到多條上游通路的精密調(diào)控，其中最著名的是Hippo通路。但在癌癥，尤其是高度惡性的三陰性乳腺癌中，是否還存在其他關(guān)鍵的、可作為治療靶點(diǎn)的上游調(diào)控因子，科學(xué)家們?nèi)栽诓粩嗵剿?。尋找并?yàn)證這些“總開關(guān)”，對于開發(fā)精準(zhǔn)打擊癌細(xì)胞的新療法至關(guān)重要。
近日，一項(xiàng)發(fā)表于《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》的研究為我們揭開了謎底。為了系統(tǒng)地篩選出對乳腺癌細(xì)胞適應(yīng)性至關(guān)重要的YAP/TAZ調(diào)控因子，研究人員展開了一場“基因大搜捕”。他們設(shè)計(jì)了一個(gè)針對216個(gè)潛在調(diào)控因子的CRISPR/Cas9 sgRNA文庫，在三種乳腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行了體外(2D/3D培養(yǎng))和體內(nèi)(小鼠腫瘤模型)的功能缺失篩選。在眾多候選基因中，一個(gè)名為FERMT2(又稱Kindlin-2)的基因脫穎而出，它編碼一種整合素信號通路的銜接蛋白。隨后的生物信息學(xué)分析揭示了FERMT2與YAP、TAZ在多種癌癥中存在著強(qiáng)烈的遺傳共依賴性。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)而通過基因敲除、沉默、功能回復(fù)等一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，深入解析了FERMT2調(diào)控YAP/TAZ的分子機(jī)制及其在腫瘤生長和化療反應(yīng)中的功能。這項(xiàng)研究不僅鑒定出FERMT2是YAP/TAZ驅(qū)動的腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵上游調(diào)控因子，還明確了整合素-FAK信號通路是其主要的作用機(jī)制，為靶向YAP/TAZ高活性腫瘤提供了新的思路。
為了開展這項(xiàng)研究，研究人員主要運(yùn)用了以下幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)：首先，他們構(gòu)建了定制的CRISPR/Cas9 sgRNA文庫，在Cas9穩(wěn)定表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行大規(guī)模體外(二維貼壁和三維球體培養(yǎng))和體內(nèi)(小鼠乳腺原位移植瘤)的遺傳篩選，以評估基因缺失對細(xì)胞適應(yīng)性的影響。其次，他們利用公共數(shù)據(jù)庫(如DepMap、TCGA、METABRIC)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，挖掘FERMT2與YAP/TAZ之間的遺傳關(guān)聯(lián)和共依賴性。最后，通過分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)手段(如基因敲除/沉默、競爭性生長實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、異種移植瘤模型、蛋白質(zhì)印跡、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫熒光等)對篩選結(jié)果進(jìn)行了系統(tǒng)的功能驗(yàn)證和機(jī)制探索。
遺傳功能缺失篩選鑒定YAP/TAZ調(diào)控因子
研究人員在三種乳腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行了CRISPR/Cas9功能缺失篩選，旨在發(fā)現(xiàn)維持乳腺癌細(xì)胞適應(yīng)性所必需的YAP/TAZ調(diào)控因子。在二維、三維及體內(nèi)篩選中，F(xiàn)ERMT2均被鑒定為關(guān)鍵性的“drop-out”基因，其缺失會導(dǎo)致細(xì)胞適應(yīng)性嚴(yán)重受損，提示其在支持YAP/TAZ依賴性細(xì)胞生存中扮演著重要的角色。
生物信息學(xué)分析表明FERMT2是YAP/TAZ的核心調(diào)節(jié)因子和選擇性弱點(diǎn)
對大規(guī)模癌癥數(shù)據(jù)庫的分析顯示，F(xiàn)ERMT2與YAP、TAZ在基因表達(dá)上呈正相關(guān)，并且三者之間存在顯著的遺傳共依賴性。更重要的是，在YAP/TAZ信號高活性的癌細(xì)胞中，F(xiàn)ERMT2是選擇性必需的“弱點(diǎn)”基因，這表明靶向FERMT2可能對這類腫瘤具有特異性殺傷作用。
實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證實(shí)FERMT2是維持三陰性乳腺癌細(xì)胞適應(yīng)性的必需因子
通過基因敲除和可誘導(dǎo)的shRNA沉默，研究人員在體外和體內(nèi)驗(yàn)證了FERMT2的功能。FERMT2的缺失顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖、軟瓊脂克隆形成以及小鼠體內(nèi)的腫瘤生長。此外，分析還發(fā)現(xiàn)FERMT2高表達(dá)的癌細(xì)胞對紫杉醇類藥物更耐藥，提示其可能參與化療抵抗的調(diào)控。
FERMT2獨(dú)立于Hippo通路激活YAP/TAZ
機(jī)制研究表明，F(xiàn)ERMT2的缺失會降低YAP/TAZ靶基因的表達(dá)、減少YAP/TAZ蛋白的核內(nèi)積累以及關(guān)鍵酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平。重要的是，在LATS1/2雙敲除(即Hippo通路失活)的細(xì)胞中，沉默F(xiàn)ERMT2依然能抑制YAP/TAZ的活性，證明FERMT2的調(diào)控不依賴于經(jīng)典的Hippo通路。相反，過表達(dá)活化的TAZ(TAZS89A)能夠完全挽回FERMT2缺失導(dǎo)致的細(xì)胞生長缺陷，確證YAP/TAZ是FERMT2的下游效應(yīng)器。
FERMT2通過FAK激活YAP/TAZ
進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ERMT2是整合素-FAK信號通路的關(guān)鍵組分。FERMT2缺失會損害FAK在Tyr397位點(diǎn)的自磷酸化及其下游SRC的激活，并減少YAP在Tyr391和Tyr444的磷酸化。藥理抑制FAK可模擬FERMT2缺失的表型，降低YAP/TAZ靶基因表達(dá)。而利用糖皮質(zhì)激素激活FAK，則能在FERMT2缺失的細(xì)胞中恢復(fù)YAP/TAZ信號，證明FAK是FERMT2調(diào)控YAP/TAZ的關(guān)鍵介質(zhì)。
FERMT2的缺失對肌動蛋白驅(qū)動的機(jī)械信號傳遞具有部分上位性
研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ERMT2對YAP/TAZ的調(diào)控部分依賴于肌動蛋白(F-actin)介導(dǎo)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但其缺失導(dǎo)致的YAP/TAZ抑制并不能完全被增強(qiáng)肌動蛋白聚合所逆轉(zhuǎn)，表明FERMT2可能還通過其他機(jī)制影響YAP/TAZ。
綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，該研究確立了FERMT2作為整合素-FAK信號通路上游，調(diào)控YAP/TAZ活性的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。FERMT2通過激活FAK，進(jìn)而促進(jìn)YAP/TAZ的酪氨酸磷酸化和核轉(zhuǎn)位，最終驅(qū)動促增殖和生存的基因表達(dá)程序。這一調(diào)控軸獨(dú)立于經(jīng)典的Hippo通路，并與肌動蛋白細(xì)胞骨架介導(dǎo)的機(jī)械信號存在部分交叉。
這項(xiàng)研究具有多重重要意義。首先，它從功能基因組學(xué)的角度，系統(tǒng)性地鑒定并驗(yàn)證了FERMT2是YAP/TAZ信號的新型關(guān)鍵激活因子，解決了該領(lǐng)域先前研究中的不一致性問題。其次，它清晰地闡明了“整合素-FERMT2-FAK-YAP/TAZ”這一信號傳導(dǎo)軸，將細(xì)胞外基質(zhì)的黏附信號與核心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控程序直接聯(lián)系起來，深化了對細(xì)胞如何整合生化與機(jī)械信號的理解。最后，也是具轉(zhuǎn)化潛力的發(fā)現(xiàn)是，F(xiàn)ERMT2在YAP/TAZ高活性腫瘤中表現(xiàn)出選擇性必需性，并且與化療抵抗相關(guān)。這提示靶向FERMT2或其下游的FAK，可能成為治療YAP/TAZ信號過度激活的惡性腫瘤(如侵襲性三陰性乳腺癌)的一種有前景的策略。該研究不僅為理解腫瘤發(fā)生提供了新的機(jī)制見解，也為開發(fā)針對“不可成藥”轉(zhuǎn)錄因子的間接靶向療法奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
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