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 酵母轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)方法.

1、接種5ml液體YPAD或10ml SC,30℃下 振蕩 培養(yǎng)過(guò)夜.
2、計(jì)數(shù)過(guò)夜培養(yǎng)物細(xì)胞密度,以zui終5×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種50ml YPAD培養(yǎng)液.
3、置30℃,200r/min振蕩培養(yǎng)至2×107個(gè)細(xì)胞/ml,通常需要3～5小時(shí),該培養(yǎng)物的細(xì)胞足夠供十次轉(zhuǎn)化用.
4、用50ml無(wú)菌離心管以3000g(2500r/min)離心5分鐘,收獲細(xì)胞.
5、棄培養(yǎng)液,把細(xì)胞懸浮在25ml無(wú)菌水中,再同上離心.
6、棄水,把細(xì)胞懸浮在1ml的100mmol/L醋酸鋰中,轉(zhuǎn)懸浮物到一個(gè)無(wú)菌1.5ml 離心管 .
7、高速 離心 5秒鐘沉淀細(xì)胞,用微量移液器吸出醋酸鋰.
8、懸浮細(xì)胞到zui終500μl體積其中大約含400μl的100mmol/L醋酸鋰.
9、將1ml單鏈載體 DNA 樣品煮沸5分鐘,快速在冰水中冷卻.
10、振蕩細(xì)胞懸浮液,取50μl樣品加到標(biāo)記的離心管中,離心沉淀細(xì)胞,用微量取樣器除去醋酸鋰.
11、基本“轉(zhuǎn)化混合液”由下列成分組成,小心按下列順序如下：
    240μl    PEG(50% w/v)
    36μl     1.0mol/L 醋酸鋰
    25μl     單鏈載體DNA(2.0mg/ml)</P< p>
    50μl     水和質(zhì)粒DNA(0.1～10μg)
12、劇烈振蕩每個(gè)反應(yīng)管每個(gè)反應(yīng)管直到細(xì)胞*混勻,通常需要1分鐘左右.
13、置30℃保溫30分鐘.
14、置42℃水浴中熱激20～25分鐘.
15、以6000～8000r/min離心15秒,用微量移液器除去轉(zhuǎn)化混合液.
16、吸0.2～1.0ml無(wú)菌水加到每個(gè)反應(yīng)管中,用移液器上下輕輕抽提以懸浮沉淀.
17、用等份的200μl轉(zhuǎn)化混合液涂選擇平板.