前 言
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了抗菌塑料的抗菌性能試驗方法和對抗菌效果的評價。本標(biāo)準(zhǔn)的抗菌性能要求和試驗方法對應(yīng)于日本國家工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)JIS Z 2801—2000《抗菌加工制品——抗菌性試驗方法和抗菌效果》（英文版），及美國材料與試驗協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)ASTM G 21—1996《合成高分子材料耐真菌性的測定》（英文版）。本標(biāo)準(zhǔn)與JIS Z 2801—2000和ASTM G21—1996的一致性程度為非等效。
本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A和附錄B為規(guī)范性附錄。
本標(biāo)準(zhǔn)由中國輕工業(yè)聯(lián)合會提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由全國塑料制品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：董曉旭、季君暉、李畢忠、顏乃泓、王友斌、陶志清、陳儀本。
本標(biāo)準(zhǔn)為發(fā)布。
引 言
抗菌塑料是一種新型的功能塑料，隨著人們對生活質(zhì)量要求的提高，其應(yīng)用日益廣泛。為保證國內(nèi)抗菌塑料制品的質(zhì)量，為抗菌塑料的評價提供統(tǒng)一的技術(shù)依據(jù)，特制定本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)主要提供抗菌塑料的試驗方法和抗菌效果評價。對于抗菌塑料的其它重要性能，如產(chǎn)品的理化性能和安全性可參考其他相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，在本標(biāo)準(zhǔn)中不作明確規(guī)定。而抗菌效果的長效性問題比較復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究，本標(biāo)準(zhǔn)暫不涉及。
抗菌塑料——抗菌性能試驗方法和抗菌效果
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)界定了抑菌、殺菌、抗菌和抗菌塑料的術(shù)語。
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了抗菌塑料抗菌性能的術(shù)語和定義、產(chǎn)品分類、抗菌性能要求和試驗方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于具有抑制/殺死細(xì)菌和（或）抑制/殺死霉菌作用的抗菌塑料，不適用于軟質(zhì)抗菌泡沫塑料和添加光觸媒類抗菌劑的抗菌塑料。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注明日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的版本。凡是不注日期的引用文件，其版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB 4789.2 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定
3 術(shù)語和定義
本標(biāo)準(zhǔn)采用以下術(shù)語和定義。
3.1 抑菌
抑制微生物生長繁殖的作用，叫做抑菌。
3.2 殺菌
殺死微生物營養(yǎng)體和繁殖體的作用叫做殺菌。
3.3 抗菌
抑菌和殺菌作用的總稱為抗菌。
3.4 抗菌塑料
具有抗菌作用的塑料稱為抗菌塑料。
4 產(chǎn)品分類
按抗菌性能可分為三種類型：
a）抗細(xì)菌型（應(yīng)符合表1的要求）；
b）抗霉菌型（應(yīng)符合表2的要求）；
c）抗（細(xì)菌和霉菌）型（應(yīng)同時符合表1和表2的要求）。
5 抗菌性能要求
5.1 抗菌塑料的抗細(xì)菌性能
抗菌塑料的抗細(xì)菌性能應(yīng)符合表1的規(guī)定。
表1
| 項目名稱 | 抗細(xì)菌率（%） |
| Ⅰ | Ⅱ |
| 抗細(xì)菌性能試驗 | ≥99 | ≥90 |
| 注：抗細(xì)菌率（見附錄A）符合Ⅰ≥99%的抗菌塑料可以報告有強(qiáng)抗細(xì)菌作用；抗細(xì)菌率符合Ⅱ≥90%的抗菌塑料可以報告有抗細(xì)菌作用。 |
5.2 抗菌塑料的抗霉菌性能
抗菌塑料的抗霉菌性能應(yīng)符合表2的規(guī)定。
表2
| 項目名稱 | 長霉等級 |
| 抗霉菌性能試驗 | 0級 | 1級 |
| 注：長霉等級（見附錄B）符合0級的抗菌塑料可以報告有強(qiáng)抗霉菌作用；長霉等級符合1級的抗菌塑料可以報告有抗霉菌作用。 |
6 試驗方法
6.1 抗細(xì)菌性能試驗
按附錄A規(guī)定的方法進(jìn)行試驗。
6.2 抗霉菌性能試驗
按附錄B規(guī)定的方法進(jìn)行試驗。
附 錄 A
（規(guī)范性附錄）
抗菌塑料——抗細(xì)菌性能試驗方法
A.1 原則
本方法通過定量接種細(xì)菌于待檢樣品上，用貼膜的方法使細(xì)菌均勻接觸樣品，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，測得樣品中的活菌數(shù)，并計算出樣品的抗細(xì)菌率。
本方法適用于抗菌塑料的抗細(xì)菌性能試驗。
A.2 條件
A.2.1 主要設(shè)備
A.2.1.1 恒溫試驗箱（37±1）℃、冷藏箱（0～5）℃、超凈工作臺、生物光學(xué)顯微鏡、壓力蒸汽滅菌器、電熱干燥箱。
A.2.1.2 滅菌平皿、滅菌試管、滅菌移液管、接種環(huán)、酒精燈。
A.2.2 主要材料
A.2.2.1 覆蓋膜
聚乙烯薄膜，標(biāo)準(zhǔn)尺寸為（40±2）mm×（40±2）mm、厚度為（0.05～0.10）mm。如試驗樣品外型尺寸較小，可按其面積減小該覆蓋膜尺寸，且保證樣品覆蓋膜部位所鋪的菌濃度不變。用70%乙醇溶液浸泡1min，再用無菌水沖洗，自然干燥。
A.2.2.2 樣品
A.2.2.2.1 陰性對照樣品
編號A，是直徑90mm或100mm的滅菌平皿的內(nèi)平板。
A.2.2.2.2 空白對照樣品
編號B,是未添加抗菌成分的塑料，標(biāo)準(zhǔn)尺寸為（50±2）mm×（50±2）mm、厚度不大于5mm?？捎门c抗菌塑料樣基材相同的樹脂、相同的加工工藝制成；也可直接從普通塑料制品（與抗菌塑料檢測樣基材相同）中裁剪，并盡可能選擇表面平整的部分。若尺寸小于50mm×50mm，應(yīng)不小于20mm×20mm，否則需將其重新加工制成標(biāo)準(zhǔn)尺寸。
A.2.2.2.3 抗菌塑料樣品
編號C，是添加抗菌成分的塑料，推薦采用標(biāo)準(zhǔn)尺寸為（50±2）mm×（50±2）mm、厚度不大于5mm。若尺寸小于50mm×50mm，應(yīng)不小于20mm×20mm，且覆蓋膜面積也相應(yīng)減小，否則將其重新加工制成標(biāo)準(zhǔn)尺寸。
以上A.2.2.2中的所有樣品在試驗前應(yīng)進(jìn)行消毒，建議用消毒劑（70%乙醇溶液）擦拭樣品表面，1min后用無菌水沖洗，自然干燥。如不適于用消毒劑處理的樣品，可直接用無菌水沖洗。
A.2.3 培養(yǎng)基和試劑
A.2.3.1 營養(yǎng)肉湯（NB）
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
氯化鈉 5.0g
制法：取上述成分加入1000ml蒸餾水中，加熱溶解后，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.0~7.2，分裝后置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，121℃滅菌30min。
A.2.3.2 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）
1000ml A.2.3.1營養(yǎng)肉湯（NB）中加入15g瓊脂，加熱熔化，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.0~7.2，分裝后置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，121℃滅菌30min。
A.2.3.3 試劑
A.2.3.3.1 消毒劑
70％乙醇溶液。
A.2.3.3.2 洗脫液
含0.80% NaCl的生理鹽水。為便于洗脫可加入少量無菌表面活性劑（如吐溫80）。用0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.0~7.2，分裝后置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，121℃滅菌30min。
A.2.3.3.3 培養(yǎng)液
營養(yǎng)肉湯（NB）/ 生理鹽水溶液。建議用于大腸桿菌的濃度為1/500，的濃度為1/100。為便于細(xì)菌分散可加入少量無菌表面活性劑（如吐溫80）制成。用0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.0~7.2，分裝后置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，121℃滅菌30min。
A.2.4 檢驗菌種
a） （Staphylococcus aureus） ATCC 6538
b） 大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922
根據(jù)產(chǎn)品的使用要求，可選用其它菌種作為檢驗菌種，但菌種應(yīng)由*菌種保藏管理中心提供。
A.3 操作步驟
A.3.1 菌種保藏
將菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）斜面上，在（37±1）℃下培養(yǎng)24h后，在（0~5）℃下保藏（不得超過1個月），作為斜面保藏菌。
A.3.2 菌種活化
將斜面保藏菌轉(zhuǎn)接到平板營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在（37±1）℃下培養(yǎng)24h，每天轉(zhuǎn)接1次，不超過2周。試驗時應(yīng)采用連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后的新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物（24h內(nèi)轉(zhuǎn)接的）。
A.3.3 菌懸液制備
用接種環(huán)從A.3.2培養(yǎng)基上取少量（刮1~2環(huán)）新鮮細(xì)菌，加入培養(yǎng)液中，并依次做10倍遞增稀釋液，選擇菌液濃度為（5.0~10.0）×105cfu/ml的稀釋液作為試驗用菌液，按GB 4789.2《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》的方法操作。
A.3.4 樣品試驗
分別取0.2ml A.3.3試驗用菌液滴加在陰性對照樣品（A）、空白對照樣品（B）和抗菌塑料樣品（C）上。每個樣品做5個平行。
用滅菌鑷子夾起滅菌覆蓋膜分別覆蓋在樣品（A）、樣品（B）和 樣品（C）上，一定要鋪平，使菌均勻接觸樣品，置于滅菌平皿中，在（37±1）℃、相對濕度RH＞90％條件下培養(yǎng)24h。
取出培養(yǎng)24h的樣品，分別加入20ml 洗脫液，反復(fù)洗樣品（A）、樣品（B）、樣品（C）及覆蓋膜（用鑷子夾起薄膜沖洗），充分搖勻后，取一定量接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）中，在（37±1）℃下培養(yǎng)（24~48）h后活菌計數(shù)，按GB 4789.2《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定的方法》測定活菌數(shù)。
以上試驗重復(fù)兩次。
A.4 檢驗結(jié)果計算
將A.3.4中測定的活菌數(shù)結(jié)果乘以100為樣品A、樣品B、樣品C培養(yǎng)24h后的實際回收活菌數(shù)值，數(shù)值分別為A、B、C，保證試驗結(jié)果要滿足以下要求，否則試驗無效：
同一空白對照樣品B的5個平行活菌數(shù)值要符合 （zui高對數(shù)值－zui低對數(shù)值）/平均活菌數(shù)值對數(shù)值≤0.3；
樣品A的實際回收活菌數(shù)值A(chǔ)應(yīng)均不小于1.0´105cfu/片，且樣品B的實際回收活菌數(shù)值B應(yīng)均不小于1.0´104cfu/片。
抗細(xì)菌率計算公式為：
R（%）=（B－C）/ B×100
式中：
R—抗細(xì)菌率（％）
B—空白對照樣品平均回收菌數(shù)（cfu/片）
C—抗菌塑料樣品平均回收菌數(shù)（cfu/片）
附 錄 B
（規(guī)范性附錄）
抗菌塑料抗霉菌性能試驗方法
B.1 原則
本方法用以測定抗菌塑料在霉菌生長的條件下對霉菌的抑制作用。
本方法規(guī)定將一定量的孢子懸液噴在待測樣品和培養(yǎng)基上，通過直接觀測長霉程度來評價抗菌塑料的長霉等級。
B.2 條件
B.2.1 主要設(shè)備
B.2.1.1 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（28±1）℃和相對濕度RH＞90%、冷藏箱（0～10）℃、超凈工作臺、離心機(jī)、生物光學(xué)顯微鏡、壓力蒸汽滅菌器、電熱干燥箱。
B.2.1.2 血球計數(shù)板、滅菌平皿、滅菌試管、滅菌移液管、滅菌離心管、滅菌錐形瓶、接種環(huán)、酒精燈。
B.2.2 主要材料
B.2.2.1 陰性對照樣品
25mm×25mm無菌濾紙。
B.2.2.2 空白對照樣品
編號A，是未添加抗菌成分的塑料，標(biāo)準(zhǔn)尺寸為（50±2）mm×（50±2）mm，厚度不大于5mm。可用與抗菌塑料樣基材相同的樹脂，相同的加工工藝制成；也可直接從普通塑料制品（與抗菌塑料樣品基材相同）中剪裁，應(yīng)保證表面平整。若尺寸小于50mm×50mm，應(yīng)不小于40mm×40mm，否則將其重新加工制成標(biāo)準(zhǔn)尺寸。
B.2.2.3 抗菌塑料樣品
編號B，是添加抗菌成分的抗菌塑料，標(biāo)準(zhǔn)尺寸為（50±2）mm×（50±2）mm，厚度不大于5mm?？捎门c抗菌塑料樣基材相同的樹脂，相同的加工工藝制成；也可直接從普通塑料制品（與抗菌塑料樣品基材相同）中剪裁。若尺寸小于50mm×50mm，應(yīng)不小于40mm×40mm，否則將其重新加工制成標(biāo)準(zhǔn)尺寸。
以上B2.2.2和B2.2.3中所有樣品試驗前均應(yīng)進(jìn)行消毒，建議用消毒劑（70%乙醇溶液）擦拭樣品表面，1min后用無菌水沖洗，自然干燥。如不適于用消毒劑處理的樣品，可直接用無菌水沖洗。
B.2.3 試劑和培養(yǎng)基
B.2.3.1 營養(yǎng)鹽培養(yǎng)液
| 硝酸鈉（NaNO3） 磷酸二氫鉀（KH2PO4） （K2HPO4） （KCl） （MgSO4 ·7H2O） （FeSO4·7H2O） 蔗糖 | 2.0g 0.7g 0.3g 0.5g 0.5g 0.01g 30g |
制法：取上述成分加入1000ml 0.05%潤濕劑水溶液中，加熱溶解后，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.0~6.5，分裝后置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)115℃滅菌30min。
B.2.3.2 營養(yǎng)鹽瓊脂培養(yǎng)基
1000ml B.2.3.1營養(yǎng)鹽培養(yǎng)液中加入15g瓊脂，加熱熔化，用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.0~6.5，分裝后置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)115℃滅菌30min。
B.2.3.3 馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）
馬鈴薯用水洗凈，去皮切成小塊。稱取200g，加1000ml蒸餾水，加熱煮沸1h。然后用雙層紗布擠出濾液，將濾液加蒸餾水1000ml，加入葡萄糖20g，瓊脂20g，加熱熔化，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.0~6.5，115℃滅菌30min。
B.2.3.4 試劑
B.2.3.4.1 消毒劑
70％乙醇溶液
B.2.3.4.2 洗脫液
土溫80、N-甲基乙磺酸（N-methyltaurine）和二辛磺化丁二酸鈉（Dioctyl Sodium Sulphosuccinate），以上潤濕劑任選一種，制成含0.05%潤濕劑水溶液，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.0~6.5，115℃滅菌30min。
B.2.4 檢測菌種
| 序號 | 名稱 | 菌號 |
| 1 | 黑曲霉（Aspergillus niger） | AS 3.4463等同ATCC 6275 |
| 2 | 土曲霉（Aspergillus terreus） | AS 3.3935 |
| 3 | 宛氏擬青霉（Paecilomyces Varioti） | AS3.4253 |
| 4 | 繩狀青霉（Penicillium funicolosum） | AS3.3875 |
| 5 | 出芽短梗霉（Aureobasium Pullulans） | AS3.3984 |
| 6 | 球毛殼（Chaetoomium globsum） | AS3.4254或ATCC6205 |
根據(jù)產(chǎn)品的使用要求，可選用其它菌種作為檢測菌種，但菌種應(yīng)由*菌種保藏管理中心提供。
B.3 操作步驟
B.3.1 菌種保藏
將菌種分別接種在馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）斜面上，在（28~30）℃下培養(yǎng)（7~14）d后，在（5~10）℃下保藏（不得超過4個月），作為保藏菌。
B.3.2 菌種活化
將保藏菌接種在PDA斜面培養(yǎng)基試管中，培養(yǎng)（7~14）d，使生成大量孢子。未制備孢子懸液時，不得拔去棉塞。每打開1支只供制備1次懸液，每次制備孢子懸液必須使用新培養(yǎng)的霉菌孢子。
B.3.3 孢子懸液制備
在培養(yǎng)（7~14）d內(nèi)B.3.2的PDA斜面培養(yǎng)基中加入少量無菌蒸餾水，用滅菌接種針輕輕刮取表面的新鮮霉菌孢子，將孢子懸液置于250ml錐形瓶內(nèi)，然后注入40ml洗脫液。
錐形瓶中加入直徑5mm的玻璃珠（10~15）粒與孢子混合，密封后置水浴振蕩器中不斷振蕩使成團(tuán)的孢子散開，然后用單層紗布棉過濾以除去菌絲。將其裝入滅菌離心管中，用離心機(jī)分離沉淀孢子，去上清液。再加入40ml洗脫液，重復(fù)離心操作3次。
用B.2.3.1營養(yǎng)鹽培養(yǎng)液稀釋孢子懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，制成濃度為（1×106±2×105）spores/ml的霉菌孢子懸液。
6種霉菌均用以上方法制成孢子懸液，將6種孢子懸液混合在一起，充分振蕩使其均勻分散。
混合孢子懸液應(yīng)在當(dāng)天使用，若不在當(dāng)天使用應(yīng)在（3~7）℃保存，4日內(nèi)使用。
B.3.4 平板培養(yǎng)基制備
無菌平皿中注入營養(yǎng)鹽瓊脂培養(yǎng)基，厚度（3~6）mm，凝固后待用（48h內(nèi)使用）。
B.3.5 霉菌活性控制
陰性對照樣品（無菌濾紙）鋪在B.3.4平板培養(yǎng)基上，用裝有新制備的混合孢子懸液的噴霧器噴孢子懸液，使其充分均勻地噴在培養(yǎng)基和濾紙上。
在溫度28℃，相對濕度90%RH以上的條件下培養(yǎng)7d，濾紙條上應(yīng)明顯有菌生長，否則應(yīng)重新制備孢子懸液。
B.3.6 樣品試驗
同時空白對照樣品A、抗菌塑料樣品B也分別鋪在B.3.4平板培養(yǎng)基上，噴孢子懸液，使其充分均勻地噴在培養(yǎng)基和樣品上。每個樣品做5個平行。
以上樣品在溫度28℃，相對濕度90%RH以上的條件下培養(yǎng)28d，若樣品長霉面積不小于10%，可提前結(jié)束實驗。
以上試驗重復(fù)兩次。
B.4 檢驗結(jié)果
取出樣品需立即進(jìn)行觀察，空白對照樣品A長霉面積應(yīng)不小于10%，否則不能作為該試驗的空白對照樣品。
樣品長霉等級：
0級 不長，即顯微鏡（放大50倍）下觀察未見生長；
1級 痕跡生長，即肉眼可見生長，但生長覆蓋面積小于10%；
2級 生長覆蓋面積不小于10%。
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