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ELISA試劑盒PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：ELISA試劑盒模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。
實(shí)驗(yàn)材料 模板DNA
試劑、試劑盒 dNTP Taq DNA聚合酶 蒸餾水 PCR緩沖液 引物 氯化鎂
儀器、耗材 PCR儀 移液槍 PCR板 薄壁管 離心管 離心管盒
實(shí)驗(yàn)步驟 一、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系
 

10×擴(kuò)增緩沖液 　 10 ul

4種dNTP混合物 　 各200 umol/L

引物 　　　　 　 各10～100 pmol

模板DNA 　　　 　0.1～2 ug

Taq DNA聚合酶 　 2.5 u

Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L

加雙或三蒸水至 　 100 ul

二、PCR引物設(shè)計(jì)

PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。

1. 引物設(shè)計(jì)的基本原則

（1） 引物長(zhǎng)度：15-30 bp，常用為20 bp左右。

（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

（3） 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。

（4）兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。

（5） 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有*互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

（6）引物3‘端的堿基，特別是zui末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，*選擇是G和C。

（7） 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

2. 引物設(shè)計(jì)軟件

Primer Premier5.0 （自動(dòng)搜索）*、Oligo6 （引物評(píng)價(jià)）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在線服務(wù)）。

三、模板的制備

（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

（2）模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。

（3）標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。

四、PCR反應(yīng)條件的控制

1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。

2. 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
　　
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
　
4. TaqDNA聚合酶2.5U（100 ul）。
　　
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
　
6. 反應(yīng)溫度

（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。

（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb（10 kb內(nèi)）。

（4）Tm值=4（G+C） +2（A+T）

7. 循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。

五、PCR的循環(huán)參數(shù)

1. 預(yù)變性（Initial denaturation）

模板DNA*變性與PCR酶的*激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū)，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。

2. 循環(huán)中的變性步驟

循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不*，易造成擴(kuò)增失敗。

3. 引物退火（Primer annealing）

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。

退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。

4. 引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶zui適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略

延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。

5. 循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

6. zui后延伸

在zui后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸*，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

六、PCR步驟

1. DNA變性

（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2. 退火

（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3. 延伸

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性*）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

七、PCR檢測(cè)

PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是zui常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。近年來(lái)以熒光探針為代表的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。展開(kāi)
注意事項(xiàng) 1. 由于PCR反應(yīng)靈敏度很高，因此要特別主意防止DNA污染的發(fā)生。樣品間的相互污染可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，特別是將PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床病原菌感染確定中。

2. 如果是公用的、沒(méi)有密碼保護(hù)的PCR儀，經(jīng)常檢查PCR儀上的程序正確與否。

3. 不使用過(guò)量試劑“less is usually better （more specific）”。

4. 試劑購(gòu)回后應(yīng)分裝成小份使用，這樣一旦有污染發(fā)生，可以立即丟棄污染的試劑，不會(huì)造成大的損失；試劑分裝也有助于減少反復(fù)凍融次數(shù)（例如dNTPs對(duì)反復(fù)凍融敏感）。

5. 加完所有試劑后用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以保證充分混勻。

6. 使用陰性對(duì)照檢查污染的發(fā)生。

7. 使用陽(yáng)性對(duì)照（能良好擴(kuò)增的樣本）。

8. 電泳時(shí)使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品（指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照系統(tǒng)失?。?。

9. 當(dāng)擴(kuò)增很長(zhǎng)的、GC含量高的模板時(shí)或容易產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板時(shí)適量使用添加劑（glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度；glycerol也可起到穩(wěn)定聚合酶活性的作用；DMSO 減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的發(fā)生，并通過(guò)減弱非特異性引物結(jié)合的穩(wěn)定性，提高反應(yīng)的特異性）。

10. 不使用帶有自動(dòng)除霜功能的冰箱存儲(chǔ)酶（避免反復(fù)凍融），每次取酶時(shí)都使用新的槍頭酶，酶使用后應(yīng)立即放回冰箱。酶要在加完緩沖液后再加，直接將酶加入水中可能導(dǎo)致酶變性失活。

11. PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間，ELISA試劑盒一般為48 h以內(nèi)，有些于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。