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上海信裕生物科技有限公司
主營產品： 培養(yǎng)基,生物培養(yǎng)基 |
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2012-9-28
銀染核仁形成區(qū)的光鏡和電鏡標本制備及觀察
【實驗目的】
通過銀染核仁形成區(qū)標本制備和觀察，了解細胞在不同時相中銀染核仁形成區(qū)的顯微
和亞顯微的形態(tài)特征。
【實驗用品】
一、材料和標本 人外周血淋巴細胞核型標本、HL 一 60 細胞、HeLa 細胞。
二、器材和儀器 顯微鏡、電子顯微鏡、超薄切片機、水浴箱、離心機、天平、染色
缸、平皿、乳頭吸管、離心管、擦鏡紙。
三、試劑 Carnoy 固定液（用時現配）、5N HCl、0.1％甲酸、l％甲酸、50％AgNO3（用
時現配）、2％蛋白膠、5％硫代*、2.5％戊二醛、30％～100％梯度乙醇和丙酮、Epon
一 812 包埋劑、醋酸鈾和檸檬酸鉛染液、蒸餾水。
【實驗內容】
一、原理和意義
在細胞分裂中期核型中，人的端著絲粒染色體短臂區(qū)和在間期細胞核的核仁中有與銀
離子特異親合物質，通過銀染可以顯示它們的致量，因此一直被人們所關注。近年來發(fā)現，
雖然人的端著絲粒染色體短臂是 28S、18S、和 5.8S rRNA 基因存在部位，稱核仁形成區(qū)
（Nucleolar organizer region，NOR），但銀染的物質不是 rDNA 和 rRNA，而是與活性的 rDNA
轉錄有關的一類酸性蛋白質，容易將 Ag ＋ 還原為 Ag 的顆粒，從而在核仁形成區(qū)鍍上銀、呈
棕黑色，稱為銀染核仁形成區(qū)（Silver—Staining nucleolar organizer region，Ag—NOR）。
生化和免疫化學研究證明銀染蛋白是RNA聚合酶I，其 功能是催化rDNA轉錄rRNA形成核仁，
因此通過這種反應能夠特異顯示 rRNA 轉錄的活性。
由于銀染核仁形成區(qū)方法簡便、特異性強，目前在遺傳、腫瘤、藥物毒理及預防醫(yī)學
等細胞生物學研究中，均有廣泛應用。特別是電鏡銀染活性核仁形成區(qū)技術，可以在同一
個細胞中顯示銀染蛋白、活性 rDNA 和 rRNA 三者間關系，并在亞細胞水平進行分析。
二、方法
（一）中期染色體核仁形成區(qū)的銀染和觀察
1．取制備好的正常或腫瘤細胞染色體標本，直接放入裝有 5N HCl 溶液中，常溫處理 5
分鐘。
2．用自來水反復沖洗幾次，甩干，標本面朝上平放在平皿中。
3．將 0.1％甲酸臨用前配制的 50％AgNO，溶液約 0.5ml,用吸管滴在標本上，再蓋上二
片擦鏡紙。
4．放置平皿于 56℃水浴中處理 3～5 分鐘，待擦鏡紙呈棕色后，取出標本用水沖洗、
氣干。
5．鏡檢
鏡下所見標本背景淺黃色，核型深染，端著絲粒染色體的銀染蛋白存在的部位呈棕黑
色顆粒，選擇染色體分散良好，銀染顆粒清楚的分裂相，進行計數單側或雙側有銀染顆粒
的染色體數。
人體細胞銀染顆粒有遺傳穩(wěn)定性，一般正常值為4～8 個／核型。
計算方法
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NOR 均值=N 個核型中含 NOR 染色體數的和/N 個核型
（二）間期細胞核活性核仁形成區(qū)的銀染與觀察
1．收集培養(yǎng)的 HL—60 細胞和用 PHA 轉化的人正常外周血淋巴細胞分別于離心管中，
用 1000rpm 離心 5 分鐘后棄上清。
2．用吸管吸打或用指彈法使細胞懸浮，然后用 Carnoy 固定液固定 30 分鐘。
3．以 1000rpm 離心 5 分鐘，棄上清剩約 0.5～0.1ml 液體，使細胞懸浮后滴片。
4．37℃干燥 24 小時
5．銀染（程序同前）
6．鏡檢
鏡下所見，細胞核著色而細胞質不著色，核中活性核仁形成區(qū)銀染顆粒呈棕黑色，成
簇聚集，清晰可分。腫瘤細胞中與正常細胞中的銀染顆粒數量、可見有明顯差異。
（三）間期細胞核銀染活性核仁形成區(qū)電鏡標本制備與觀察
1．收集培養(yǎng)的 HL--60 細胞或 HeLa 細胞于離心管中，隨后加入 2.5％戊二醛 1ml 預固
定 10 分鐘。
2．以 1000rpm 離心 10 分鐘，棄上清后加入 Carnoy 固定液固定 5 分鐘。
3．接著以 2500rpm 離心 lO 分鐘，棄凈上清并用吸水紙吸干殘余液體，用耳勺取出細
胞團塊放于小平皿中。
4．100％乙醇→雙蒸水梯度復水，每步 5 分鐘。
5．然后將細胞團切成約 1mm 3 大小的塊。
6．將 50％AgN03（用蒸餾水配制）—2％蛋白膠（用 1％甲酸配制）2:1 混合液 2～3ml，加
入有細胞團塊的小平皿中。
7．移置平皿于 56℃水浴中處理 20 分鐘。
8．*水洗 3 次，每次 2～3 分鐘。
9．水洗后 5％硫代*室溫處理 lO 分鐘。
10．再水洗 3 次，轉入乙醇一丙酮梯度脫水，每步 5 分鐘。
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