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銀染核仁形成區(qū)的光鏡和電鏡標(biāo)本制備及觀察

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>

通過(guò)銀染核仁形成區(qū)標(biāo)本制備和觀察，了解細(xì)胞在不同時(shí)相中銀染核仁形成區(qū)的顯微

和亞顯微的形態(tài)特征。

【實(shí)驗(yàn)用品】

一、材料和標(biāo)本 人外周血淋巴細(xì)胞核型標(biāo)本、HL 一 60 細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞。

二、器材和儀器 顯微鏡、電子顯微鏡、超薄切片機(jī)、水浴箱、離心機(jī)、天平、染色

缸、平皿、乳頭吸管、離心管、擦鏡紙。

三、試劑 Carnoy 固定液（用時(shí)現(xiàn)配）、5N HCl、0.1％甲酸、l％甲酸、50％AgNO3（用

時(shí)現(xiàn)配）、2％蛋白膠、5％硫代*、2.5％戊二醛、30％～100％梯度乙醇和丙酮、Epon

一 812 包埋劑、醋酸鈾和檸檬酸鉛染液、蒸餾水。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一、原理和意義

在細(xì)胞分裂中期核型中，人的端著絲粒染色體短臂區(qū)和在間期細(xì)胞核的核仁中有與銀

離子特異親合物質(zhì)，通過(guò)銀染可以顯示它們的致量，因此一直被人們所關(guān)注。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，

雖然人的端著絲粒染色體短臂是 28S、18S、和 5.8S rRNA 基因存在部位，稱核仁形成區(qū)

（Nucleolar organizer region，NOR），但銀染的物質(zhì)不是 rDNA 和 rRNA，而是與活性的 rDNA

轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一類酸性蛋白質(zhì)，容易將 Ag ＋ 還原為 Ag 的顆粒，從而在核仁形成區(qū)鍍上銀、呈

棕黑色，稱為銀染核仁形成區(qū)（Silver—Staining nucleolar organizer region，Ag—NOR）。

生化和免疫化學(xué)研究證明銀染蛋白是RNA聚合酶I，其 功能是催化rDNA轉(zhuǎn)錄rRNA形成核仁，

因此通過(guò)這種反應(yīng)能夠特異顯示 rRNA 轉(zhuǎn)錄的活性。

由于銀染核仁形成區(qū)方法簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，目前在遺傳、腫瘤、藥物毒理及預(yù)防醫(yī)學(xué)

等細(xì)胞生物學(xué)研究中，均有廣泛應(yīng)用。特別是電鏡銀染活性核仁形成區(qū)技術(shù)，可以在同一

個(gè)細(xì)胞中顯示銀染蛋白、活性 rDNA 和 rRNA 三者間關(guān)系，并在亞細(xì)胞水平進(jìn)行分析。

二、方法

（一）中期染色體核仁形成區(qū)的銀染和觀察

1．取制備好的正?；蚰[瘤細(xì)胞染色體標(biāo)本，直接放入裝有 5N HCl 溶液中，常溫處理 5

分鐘。

2．用自來(lái)水反復(fù)沖洗幾次，甩干，標(biāo)本面朝上平放在平皿中。

3．將 0.1％甲酸臨用前配制的 50％AgNO，溶液約 0.5ml,用吸管滴在標(biāo)本上，再蓋上二

片擦鏡紙。

4．放置平皿于 56℃水浴中處理 3～5 分鐘，待擦鏡紙呈棕色后，取出標(biāo)本用水沖洗、

氣干。

5．鏡檢

鏡下所見(jiàn)標(biāo)本背景淺黃色，核型深染，端著絲粒染色體的銀染蛋白存在的部位呈棕黑

色顆粒，選擇染色體分散良好，銀染顆粒清楚的分裂相，進(jìn)行計(jì)數(shù)單側(cè)或雙側(cè)有銀染顆粒

的染色體數(shù)。

人體細(xì)胞銀染顆粒有遺傳穩(wěn)定性，一般正常值為4～8 個(gè)／核型。

計(jì)算方法

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NOR 均值=N 個(gè)核型中含 NOR 染色體數(shù)的和/N 個(gè)核型

（二）間期細(xì)胞核活性核仁形成區(qū)的銀染與觀察

1．收集培養(yǎng)的 HL—60 細(xì)胞和用 PHA 轉(zhuǎn)化的人正常外周血淋巴細(xì)胞分別于離心管中，

用 1000rpm 離心 5 分鐘后棄上清。

2．用吸管吸打或用指彈法使細(xì)胞懸浮，然后用 Carnoy 固定液固定 30 分鐘。

3．以 1000rpm 離心 5 分鐘，棄上清剩約 0.5～0.1ml 液體，使細(xì)胞懸浮后滴片。

4．37℃干燥 24 小時(shí)

5．銀染（程序同前）

6．鏡檢

鏡下所見(jiàn)，細(xì)胞核著色而細(xì)胞質(zhì)不著色，核中活性核仁形成區(qū)銀染顆粒呈棕黑色，成

簇聚集，清晰可分。腫瘤細(xì)胞中與正常細(xì)胞中的銀染顆粒數(shù)量、可見(jiàn)有明顯差異。

（三）間期細(xì)胞核銀染活性核仁形成區(qū)電鏡標(biāo)本制備與觀察

1．收集培養(yǎng)的 HL--60 細(xì)胞或 HeLa 細(xì)胞于離心管中，隨后加入 2.5％戊二醛 1ml 預(yù)固

定 10 分鐘。

2．以 1000rpm 離心 10 分鐘，棄上清后加入 Carnoy 固定液固定 5 分鐘。

3．接著以 2500rpm 離心 lO 分鐘，棄凈上清并用吸水紙吸干殘余液體，用耳勺取出細(xì)

胞團(tuán)塊放于小平皿中。

4．100％乙醇→雙蒸水梯度復(fù)水，每步 5 分鐘。

5．然后將細(xì)胞團(tuán)切成約 1mm 3 大小的塊。

6．將 50％AgN03（用蒸餾水配制）—2％蛋白膠（用 1％甲酸配制）2:1 混合液 2～3ml，加

入有細(xì)胞團(tuán)塊的小平皿中。

7．移置平皿于 56℃水浴中處理 20 分鐘。

8．*水洗 3 次，每次 2～3 分鐘。

9．水洗后 5％硫代*室溫處理 lO 分鐘。

10．再水洗 3 次，轉(zhuǎn)入乙醇一丙酮梯度脫水，每步 5 分鐘。

11．