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　　細(xì)胞中的微絲染色及微絲與細(xì)胞形態(tài)的實(shí)驗(yàn)觀察
　　
　　【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />　　
　　掌握微絲的染色方法，了解光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下微絲的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　
　　【實(shí)驗(yàn)用品】
　　
　　一、材料和標(biāo)本蓋片培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞三片。
　　
　　二、器材和儀器光學(xué)顯微鏡一臺、鑷子一把、小平皿六個、載片三個、吸水紙、37℃
　　
　　恒溫箱。
　　
　　三、試劑PBS（pH7.2）、2％TritonX—100液、M—緩沖液、3％戊二醛固定液、0.2
　　
　?。タ捡R斯亮蘭染液、100μg／ml的細(xì)胞松馳素B、DMEM培養(yǎng)液。
　　
　　【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】
　　
　　一、成纖維細(xì)胞微絲的染色及其對細(xì)胞松馳素B的反應(yīng)
　　
　?。ㄒ唬┰?br />　　
　　微絲普遍存在于多種細(xì)胞，對細(xì)胞的形狀和運(yùn)動有一定作用。細(xì)胞松馳素B可與微絲
　　
　　的亞單位肌動蛋白結(jié)合，從而破壞微絲，改變細(xì)胞的形狀。
　　
　　（二）細(xì)胞松馳素B處理成纖維細(xì)胞與染色觀察
　　
　　1．在平皿中有三張成纖維細(xì)胞貼壁生長的蓋片，在超凈工作臺內(nèi)將一張蓋片移入另一
　　
　　皿中繼續(xù)培養(yǎng)，用作對照。
　　
　　2．在有兩片的平皿內(nèi)加100μg／ml的細(xì)胞松弛素B4滴繼續(xù)培養(yǎng)半小時。
　　
　　3.將用細(xì)胞松弛素B處理過的兩張蓋片取一張做染色處理，另一張用培養(yǎng)液洗五次（在
　　
　　平皿內(nèi)換五次培養(yǎng)液，每次都要搖動），繼續(xù)培養(yǎng)、觀察。兩小時后細(xì)胞形狀恢復(fù)，接近正
　　
　　常。
　　
　　4．對恢復(fù)的蓋片與*張沒用藥的蓋片一同做染色處理。
　　
　　5．染色處理
　　
　?、賹⑿枞旧纳w片放入盛有PBS的平皿內(nèi)用吸管輕輕吹洗蓋片，換液三次，每次3分
　　
　　鐘，洗去培養(yǎng)液。
　　
　　②將蓋片移入2％TritonX一100液，置37℃恒溫箱內(nèi)處理20～30分鐘，以提取骨
　　
　　架以外的蛋白質(zhì)，使骨架圖像清晰。
　　
　?、哿⒖虒⑸w片移入M一緩沖液，換洗三次，每次3分鐘。M一緩沖液有穩(wěn)定細(xì)胞骨架的
　　
　　作用。
　　
　?、軐⑸w片移入3％戊二醛固定15分鐘。
　　
　?、輰⑸w片移入0.2％考馬斯亮蘭染液中，染色15分鐘。然后小心地用自來水沖洗，空
　　
　　氣干燥。
　　
　?。ㄈ┙Y(jié)果
　　
　　光鏡觀察，微絲聚集成的張力纖維束被染成藍(lán)色。在沒用藥的標(biāo)本上，成纖維細(xì)胞多
　　
　　數(shù)有突起，微絲沿突起規(guī)則排列；用細(xì)胞松馳素B處理的標(biāo)本，由于微絲被破壞突起縮回，
　　
　　多數(shù)細(xì)胞形狀變圓；用藥處理后又洗去藥的標(biāo)本，由于解除了藥的作用，肌動蛋白重新聚
　　
　　臺形成微絲，細(xì)胞形狀恢復(fù)正常。
　　
　　二、麗藻細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)環(huán)流及其對細(xì)胞松弛素B的反應(yīng)
　　
　?。ㄒ唬┰?br />　　
　　麗藻細(xì)胞大，整個細(xì)胞的*為大液泡占據(jù)。靠近液泡是一層溶膠樣流動的內(nèi)質(zhì)，在
　　
　　17
　　
　　內(nèi)質(zhì)與質(zhì)膜之間，為靜止的外質(zhì)，其中含有葉綠體。內(nèi)質(zhì)中含有許多顆粒，可以清楚地看
　　
　　到胞質(zhì)環(huán)流。在麗藻細(xì)胞中的微絲與胞質(zhì)環(huán)流有密切關(guān)系。成束的微絲出現(xiàn)在外質(zhì)與內(nèi)質(zhì)
　　
　　接口（溶膠和凝膠接口）并交織一起，與環(huán)流方向平行。用細(xì)胞松弛素B處理后，就可抑制
　　
　　胞質(zhì)的環(huán)流運(yùn)動。
　　
　?。ǘ┓椒?br />　　
　　1．剪下一小塊麗藻葉片（1～2cm），置于載片上，蓋上蓋片。
　　
　　2．觀察（陽光充足時效果較好）。
　　
　　3．再取一塊麗藻葉片，滴一滴細(xì)胞松弛素B，10~15分鐘后蓋上蓋片，觀察。
　　
　　4．洗去藥物，再觀察。
　　
　?。ㄈ┙Y(jié)果
　　
　　在麗藻內(nèi)質(zhì)中可以看到胞質(zhì)環(huán)流，用細(xì)胞松弛素B處理后，胞質(zhì)環(huán)流停止，洗去藥物，
　　
　　又出現(xiàn)胞質(zhì)環(huán)流。
　　
　　三、微絲的電鏡照片觀察
　　
　　恒河猴脊髓內(nèi)神經(jīng)纖維中微絲電鏡照片，可見微絲是實(shí)心結(jié)構(gòu)，直徑5～8cm，它均勻
　　
　　地分散于細(xì)胞基質(zhì)中，或排列成束和網(wǎng)狀。
　　
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