定量蛋白質(zhì)組學(xué)之SILAC技術(shù)
因組織樣品的復(fù)雜度以及代謝標(biāo)記在非增殖細(xì)胞上的限制，組織蛋白質(zhì)組學(xué)面臨了很大挑戰(zhàn)。之前，研究人員使用SILAC標(biāo)記的細(xì)胞作為“spike-in”對照，解決了標(biāo)記問題，因?yàn)橥ㄟ^與對照比較，可進(jìn)行每種組織樣品的定量。日本科學(xué)家曾將標(biāo)記的Neuro2A細(xì)胞裂解液加入小鼠的腦組織裂解液中，開展小鼠腦組織的定量蛋白質(zhì)組研究。
然而，考慮到組織的復(fù)雜度，以單個(gè)細(xì)胞系來代表組織似乎是不夠的。此外，若樣品是多樣性的，如腫瘤樣品，則單個(gè)細(xì)胞系也無法代表這種多樣性。為了克服這些挑戰(zhàn)，Matthias Mann教授及其同事將多個(gè)SILAC標(biāo)記的細(xì)胞系混合在一起，作為“spike-in”對照，這就是Super-SILAC（超級(jí)SILAC）。
他們將多個(gè)過去建立的癌癥細(xì)胞系中的標(biāo)記蛋白裂解液混合，這樣就復(fù)雜度而言，它們比單個(gè)細(xì)胞系更為全面，從而增加了準(zhǔn)確性。為了代表更寬范圍的特定腫瘤類型，他們選擇了不同來源、不同階段，且攜帶各種分子標(biāo)記物的細(xì)胞系，并將等量的標(biāo)記蛋白混合成超級(jí)SILAC混合物（super-SILAC mix）。隨后將這些標(biāo)記蛋白裂解液以1：1的比例與每種組織樣品混合，裂解液充當(dāng)了組織比較的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
在乳腺癌組織的研究中，Mann及其同事通過標(biāo)記四種乳腺癌細(xì)胞系，外加一種正常的乳腺上皮細(xì)胞類型，以1：1：1：1：1的比例將蛋白裂解液混合，獲得了完整的SILAC-標(biāo)記蛋白。他們比較了小葉和導(dǎo)管乳腺腫瘤中與轉(zhuǎn)變過程、化療敏感性和藥物抗性相關(guān)的低豐度蛋白。
這種新方法有潛力將相對蛋白質(zhì)組定量方法擴(kuò)展到腫瘤生物學(xué)研究的分子方面，并可能成為探索候選生物標(biāo)記物的工具。SILAC與其他相對定量的質(zhì)譜技術(shù)相比，優(yōu)勢在于靈敏度高、定量準(zhǔn)確，且實(shí)驗(yàn)誤差很小，因?yàn)闃悠吩趯?shí)驗(yàn)流程的早期就已混合。此外，超級(jí)SILAC方法還有可能成為了解癌癥分子機(jī)制的寶貴工具。
開展SILAC研究的工具
賽默飛世爾（Thermo Fisher Scientific）在收購HyClone和Pierce之后，在SILAC方面的產(chǎn)品線還是相當(dāng)豐富的。除了經(jīng)典的SILAC培養(yǎng)基（RPMI-1640和DMEM）外，賽默飛世爾近年來也推出了不少新產(chǎn)品。
SILAC培養(yǎng)基 & 血清
所有的SILAC培養(yǎng)基都不含有L-賴氨酸和L-精氨酸。對于經(jīng)典的RPMI-1640和DMEM，賽默飛世爾提供了液體（500mL）和粉劑（可配成10L）的包裝。除此之外，它還有專門用于SILAC的MEM、DMEM:F12、F12、IMDM、McCoy’s 等培養(yǎng)基。當(dāng)然，這些還不夠。為了滿足干細(xì)胞研究的需求，它還推出了用于SILAC的小鼠干細(xì)胞擴(kuò)增DMEM，低滲透壓小鼠干細(xì)胞DMEM。而無酚紅MEM培養(yǎng)基適用于易受雌激素刺激的細(xì)胞，如乳腺癌細(xì)胞系MCF7，而不會(huì)產(chǎn)生人為的雌激素反應(yīng)。此外，賽默飛世爾還提供透析過的FBS、干細(xì)胞的透析FBS以及血清替代物。
重型 & 輕型氨基酸
賽默飛世爾還單獨(dú)提供了同位素標(biāo)記的氨基酸，可與上面提到的缺陷型培養(yǎng)基共同使用。重型和輕型L-賴氨酸和L-精氨酸是SILAC分析中zui常用的氨基酸。利用氨基酸的不同同位素，可輕松分析三種不同的實(shí)驗(yàn)條件。以賴氨酸為例，4,4,5,5-D4 L-賴氨酸和13C6 15N4標(biāo)記的L-賴氨酸與輕型賴氨酸相比分別有4-和8-Da的分子量變化。而13C6 L-精氨酸和13C6 15N4 L-精氨酸則分別比輕型精氨酸的分子量高了6-和10-Da。L-亮氨酸也是SILAC中很常用的氨基酸。此外，賽默飛世爾還提供了L-脯氨酸作為培養(yǎng)基添加劑，以防止同位素標(biāo)記的精氨酸代謝轉(zhuǎn)換成脯氨酸。
SILAC實(shí)驗(yàn)流程
據(jù)賽默飛世爾介紹，SILAC流程如下：利用含有0.1毫克/毫升的重13C6 L-賴氨酸-2HCl或輕L-賴氨酸-HCl，并且在含有10%透析過的FBS的SILAC DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)A549細(xì)胞，培養(yǎng)六代（10天）。在*標(biāo)記后，利用5 μM喜樹堿處理13C6 L-賴氨酸標(biāo)記的細(xì)胞24小時(shí)。利用Thermo Scientific M-PER哺乳動(dòng)物細(xì)胞總蛋白抽提試劑裂解來自每種樣品（輕和重）的細(xì)胞。將樣品按照使用Thermo Scientific BCA蛋白定量試劑測定的蛋白濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后從每種樣品中取50毫克并混勻，此后利用4-20%的SDS-PAGE分析樣品。利用Thermo Scientific GelCode藍(lán)色染色試劑對凝膠進(jìn)行染色，再利用Thermo Scientific 膠內(nèi)胰酶消化試劑盒對蛋白進(jìn)行消化和烷基化，zui后利用LTQ Orbitrap雜交質(zhì)譜進(jìn)行分析。
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