目前研究人員對于突變數據的驗證一般采用Sequenom質譜、Sanger測序法。雖然這兩種方法的準確性很高，但是Sequenom方法對未知位點突變無法進行檢測，且很多分析仍然需要借助人工方法，而Sanger測序法通量低、花費大且同樣存在人工誤差的問題。此外采用多種測序平臺進行交叉驗證也大大降低了效率，且產生新的突變類型導致更加復雜的分析。所以，是利用已有的測序平臺直接產生高質量的測序數據，zui大程度避免其他方法的交叉驗證。“基于這些考慮，我們對PacBio給予了厚望。隨著項目進展，現在它已經成為我們的標準工具。”
我們從千人基因組計劃產生的SNP數據中挑選了98個已經用其他方法驗證過的難測SNP位點，盡管之前沒人知道為什么這些位點那么難測，“但事實就是，這些位點在一般其他的測序儀上測的話總是一如既往地出錯”，所以這些位點就成了測試測序儀性能的標準。我們分別利用PacBio平臺和Illumina MiSeq平臺進行對比驗證，結果發(fā)現PacBio數據有著更好的準確性和假陽性檢出率，相對而言是一種更為有效的驗證工具。
注: 詳情請見參考文獻6、參考影像7/10、生物通往期文章1/2/3/10。
Matthew Meyerson：
Broad研究院正努力把PacBio做成基因分型、變異驗證與重復實驗的平臺，并專門為PacBio開發(fā)了補充算法，用于糾正其隨機誤差，并將新算法包含在GATK基因組分析工具包內。
“PacBio單分子測序技術能對基因組中的低頻變異進行解讀，且能夠有效彌補Sequenom和Sanger方法的缺陷，可以尋找除已知位點以外的其他漏檢稀有突變。”
我們利用PacBio平臺對92株成神經管細胞瘤（Medulloblastoma）原代細胞株的全外顯子組的Illumina測序結果進行了體細胞變異位點的驗證分析。不僅驗證了所有發(fā)現的SNP，連（在CTDNEP1基因中）短到2 bp的微缺失（Indel）變異也得到了很好的區(qū)分和識別。我們zui終確認了12個與成神經管細胞瘤發(fā)生相關的變異，并發(fā)現了一個以前從未發(fā)現的突變，為這種疾病的基礎研究和臨床診斷提供了新的分子標記物。
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