微生物限度檢查法 -結(jié)果判定

　　被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值大于70%，且菌落形態(tài)大小

應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。計數(shù)方法的驗證當建立產(chǎn)

品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認所采用的方法

適合于該產(chǎn)品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響

檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。驗證時，按供試液的制備和細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)

定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應(yīng)逐一進行驗證。菌種及菌液制備 同計數(shù)培養(yǎng)

基的適用性檢查驗證方法 驗證試驗至少應(yīng)進行3 次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次

試驗的回收率。

　?。?）試驗組 平皿法計數(shù)時，取試驗可能用的zui低稀釋級供試液1ml 和50～100cfu 試驗

菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌

數(shù)。薄膜過濾法計數(shù)時，取規(guī)定量試驗可能用的zui低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在zui后一次

的沖洗液中加入50～100cfu 試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。
 

　?。?）菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。

　?。?）供試品對照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

　?。?）稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理

時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應(yīng)

的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使zui終菌濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗組的

供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。結(jié)果判斷 在3 次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照

組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70%。

若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平

均菌落數(shù)的百分率）均不低于70%，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵

母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜

過濾法、中和法（表1）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗

證。表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物 可選用的中和劑或滅活方法戊二醛 亞硫酸氫

納酚類、乙醇、吸附物 稀釋法醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物（QACs）、對

羥基苯甲酸酯、 卵磷脂、聚山梨酯汞類制劑 亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類化

合物 卵磷脂酒、洗必泰類 聚山梨酯鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸（EDTA） 鎂或鈣離子磺

胺類 對氨基苯甲酸。
 

　　若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是

因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對

試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限

度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋

級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為zui低稀釋級的

供試液進行供試品檢驗。計數(shù)方法驗證時，采用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率

達不到要求，那么選擇回收情況zui接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。驗證試驗也

可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進行。

供試品檢查

　　計數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的細菌、霉

菌及酵母菌菌數(shù)的測定?？刂凭鷻z查方法的驗證當建立藥品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進行控

制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查。若藥品的組分或原檢

驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢查方法應(yīng)重新驗證。驗證時，依各品種項下微生物限

度標準中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查法時，應(yīng)采用大腸埃希菌

作為驗證菌株。驗證試驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進行。菌種及菌液

制備 同控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查 。

驗證方法

　　取規(guī)定量供試液及10～100cfu 試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進行檢查。

當采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在zui后一次沖洗液中，過濾

后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。結(jié)果判斷 若上述試驗檢出試驗菌，按此供

試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)采用培養(yǎng)

基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑

菌活性，并重新進行方法驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。供試品檢查供

試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗證的方法進行，增菌培養(yǎng)基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。

陽性對照試驗 供試品進行控制菌檢查時，應(yīng)做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10～

100cfu，方法同供試品的控制菌檢查。陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陰性對照試驗 取稀

釋液10ml 照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長。